基于网络药理学探讨国医大师张磊运脾汤治疗高脂血症的分子机制＊

林远茂，施荣聪，黄宝特，徐世安，孙玉信，姜 枫

（1. 广西中医药大学研究生院 南宁 530011；2. 广西中医药大学附属瑞康医院 南宁 530011；3. 河南中医药大学第三附属医院 郑州 450003）

高脂血症（Hyperlipidemia）是人体脂质代谢的异常的一种表现，其特征在于总胆固醇、甘油三酸酯和低密度脂蛋白胆固醇的升高，或伴随着高密度脂蛋白胆固醇的循环水平降低[1]。高脂血症相关的脂质疾病被认为是动脉粥样硬化性心血管疾病的主要原因，高脂血症已被列为导致冠心病患病率和严重性的最大危险因素之一[2]。随着生活习惯的改变和膳食营养的提高，人体摄入高脂肪和高糖分含量的食物越来越多，高脂血症患者数量逐年上升，高脂血症已经成为危害全球健康的危险因素[3]。目前，国内外对中草药降低血浆胆固醇水平的作用做了充分研究，证实中草药在降低胆固醇水平方面的有效性和安全性[4]。古代中医书籍中，可见“膏粱”“高脂”等关于现代高脂血症的相关记载；中医认为，高脂血症常伴有“血瘀”“痰浊”“湿阻”等特征，在中医理论的指导下，中医药在临床上已广泛应用于高脂血症及其相关并发症的治疗，具有疗效明显、毒副作用小的优点[5]。

运脾汤是国医大师张磊教授“临证八法”中“运通法”的代表方，在“腑以通为顺”“脾以运为健”的基本思想上立法组方，其主要药物组成有槟榔、炒牵牛子、豆蔻、茯苓、炒麦芽、炒神曲、炒山楂等药物，具有运脾化积，消食导滞等功效，临床多用于治疗饮食失节、脾湿过盛，运化失常所致的诸多病症[6]。本研究通过运用网络药理学等数据挖掘和分析的方法，探讨“中药有效成分-靶点-疾病”之间的复杂作用关系，从而挖掘国医大师张磊运用运脾汤治疗高脂血症的现代药理作用机制，为运脾汤治疗高脂血症的进一步探讨提供参考。

1 资料与方法

1.1 运脾汤有效化学成分的收集和筛选及靶点预测

通过检索TCMSP 数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php），将同时满足口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18的化合物作为纳入标准[7]，得到山楂、麦芽、莱菔子、陈皮、半夏、茯苓、连翘、槟榔、牵牛子、甘草的潜在活性化合物成分及相关靶点；查阅相关文献对神曲的潜在活性成分进行补充。Pharm Mapper 数据库（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），对已筛选出的部分潜在有效化学成分进行靶点预测补充，在数据库中不能预测到作用靶点的成分则剔除。通过UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/）筛选人源靶点并进行基因注释。

1.2 高脂血症疾病靶点的收集

在GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）和DisGeNET 数据库（http://www.disgenet.org/）这两个数据库中，以“Hyperlipidemia”为检索词检索，综合获取的数据，去除重复值，取并集，得到高脂血症疾病的相关疾病基因。

1.3 预测运脾汤治疗高脂血症的相关靶点

运用Venny 平台（2.1，http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）将运脾汤中有效化学成分所对应的相关靶点与高脂血症的疾病靶点取交集，得到运脾汤治疗高脂血症的相关靶点。

1.4 运脾汤治疗高脂血症相关靶点的PPI 网络图与分析

将运脾汤的靶点基因和高脂血症疾病基因取的交集，导入STRING 数据库（https://string-db.org/）构建其蛋白互相作用（PPI）网络图，分析运脾汤治疗高脂血症相关靶点之间的相互作用关系。使用Cytoscape（3.6.0）软件进行蛋白互作网络可视化处理，并通过Network Analyzer分析网络中节点的拓扑参数。

1.5 化合物与靶点分子对接

iGEMDOCK 是通用进化方法用于计算相对于靶蛋白活性位点的配体构象和方向的软件。可以用于初步筛选和精度对接。其结果以能量的高低去判断靶蛋白与配体的结合程度，通常靶蛋白与化合物配体结合的构象稳定时的能量越低，说明发生作用的可能性越大。根据1.4 中通过计算拓扑学参数得到的degree值排名前10类的靶蛋白，在PDB数据库（https://www.rcsb.org/）检索，并保持其pdb 格式文件。根据1.4中度值（degree）≥5 的化合物在TCMSP 数据库获取其化合物配体mol2格式文件。

1.6 生物信息学分析

运用DAVID 生物信息学资源平台6.8（https://david.ncifcrf.gov/）做交集基因的GO 富集分析与KEGG富集分析。限定研究物种为人类，选择Gene Ontology下的分子功能（Molecular Function）、生物过程（Biological Process）和细胞组成（Cellular Component）3个部分进行GO 富集分析，选择Pathway 分析中KEGG Pathway，设定显著性为P＜0.05，进一步寻找活性成分作用靶点显著富集的主要功能注释与信号转导通路。

1.7 构建“中药材-有效化学成分-靶点-通路”综合网络

将所有分析结果整理并导入Cytoscape（3.6.0）软件，处理得到“中药材-有效化学成分-靶点-通路”综合网络图。

2 结果

2.1 运脾汤有效化合物和相关靶点

在运脾汤中，去除鸡内金和鳖甲两味未检索到对应化合物信息，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 为标准，筛选得到山楂有6 种有效化合物及其对应的人源靶点144 个、麦芽18 种对应56 个、莱菔子3种对应4个、陈皮5种对应41个、半夏13种对应73 个、茯苓15 种对应15 个、连翘23 种对应219 个、槟榔8 种对应13 个、牵牛子22 种对应111 个、甘草92种对应720 个，神曲8 种对应146 个，去除重复化合物及重复靶点，运脾汤共计128 种有效成分对应人源靶点142个。

2.2 高脂血症疾病靶点数据库

在GeneCards 数据库中，初步筛选获得1164 个与高脂血症相关的候选基因，根据“Relevance score”度值，选取相关度较高的前600 个结果，在DisGeNET 数据库中检索，发现231 个相关基因，经合并数据库查询，去除重复共筛选出718 个与高脂血症高度相关性靶点。

2.3 运脾汤治疗高脂血症的相关靶点和活性化学成分

通过Venny平台分析得到运脾汤中干预高脂血症的靶点40 个（图1），其中共涉及128 个有效化学成分（表1）。在运脾汤所有有效化学成分中，与关键靶点关系密切的前10的有效化学成分的结构（图2）。

表1 运脾汤有效化学成分详细信息

续表1

续表1

图1 运脾汤作用靶点与高脂血症靶点韦恩图

2.4 运脾汤治疗高脂血症相关靶点的PPI 网络图与分析

将运脾汤干预高脂血症的40个靶点导入STRING数据库进行蛋白质相互作用分析，设置可信度为0.4，得到靶点之间相互作用关系。导入Cytoscape（3.6.0）软件进行可视化（图3）。在Cytoscape（3.6.0）软件中，通过Network Analyzer 功能分析网络中的拓扑参数，根据degree结果显示，胰岛素（INS）、白介素6（IL6）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、过氧化物酶体增殖物激活的受体γ（PPARG）、一氧化氮合酶（NOS3）、表皮生长因子受体（EGFR）、载脂蛋白B（APOB）、细胞间粘附分子1（ICAM1）、CAV1和雌激素受体（ESR1）为运脾汤干预高脂血症的核心靶点；且运脾汤中干预高脂血症的活 性 化 学 成 分naringenin、quercetin、kaempferol 和luteolin主要来源于连翘、山楂、神曲、陈皮、甘草。

表2 运脾汤干预高脂血症蛋白互作拓扑学分析（按度值排序取前10个）

2.5 分子对接结果

iGEMDOCK 分子对接结果将运脾汤干预高脂血症的10 个关键靶点与运脾汤中经拓扑学参数计算的22个关键化合物进行分子对接，靶蛋白与化合物配体结合的构象稳定时能量越低发生的作用可能性越大[8]，分析结合力具体参数（图4）和具体分子对接参数（表3），其中结合性最强的是NOS3与nobiletin（图5）。

2.6 运脾汤主要活性成分对高脂血症作用靶点的生物信息学分析结果

图2 网络中度值排名前10的有效化学成分结构

图3 运脾汤干预高脂血症相关靶点间蛋白互作关系

通过DAVID 数据库进行GO 功能富集分析，结果得到48 个GO 功能富集条目，其中涉及生物过程（BP）的相关条目最多，共计30 条，主要包括一氧化氮生物合成过程的正调控、细胞对肿瘤坏死因子的反应、上皮细胞增殖的正调控、肽基酪氨酸磷酸化的正调控、RNA 聚合酶II 启动子转录的正调控、蛋白质磷酸化的正调控、蛋白激酶B 信号转导的正调控和凋亡过程的负调控等方面；其中有7 条细胞组成（CC），主要包括膜筏、受体复合体、基底外侧质膜、质膜的外侧和内体膜等方面；并有11 条分子功能（MF），主要包括类固醇激素受体活性、酶结合和蛋白质酪氨酸激酶活性等方面（图6）。

KEGG 通路富集分析得到48 条信号通路，其中按Gene Ratio 值选取25 条富集结果最相关的信号通路，导入RSudio 软件制作高级气泡图进行分析（图7、表3）。包括HIF-1 信号通路、胰岛素信号通路、PI3KAkt 信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、Fox O信号通路、TNF信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化和卵巢类固醇生成等通路。分析靶点与相关性较大的通路HIF-1 信号通路的作用关系（图8），红色为表达促进作用。

2.7 构建“中药材-有效化学成分-靶点-通路”综合网络

图4 运脾汤主要化学成分与关键靶点对接结果

图5 NOS3与nobiletin

根据上述结果，绘制网络药理学分析运脾汤干预高脂血症的各元素综合网络图，根据degree 调节节点大小，使核心靶点和主要有效化学成分在网络图中突出表现（图9）。网络图中共包括249 个节点、680 条边；图中左侧的模块分别为运脾汤各组成中药及其主要化学成分，其中红色六边形节点为中药，蓝色菱形为其化学成分；右侧的模块为绿色圆形为40个关键靶点，最右侧外方的紫色三角形模块为KEGG 分析排名前10的信号通路。

3 讨论

高脂血症是由血脂代谢异常引起的较为常见的代谢性疾病，亦是目前公认的动脉粥样硬化性心血管疾病的高危诱导因素。生活水平和饮食结构的改变，越来越多的人存在血脂异常症状。长期高水平的血脂容易诱冠心病、胰腺炎和高血压等疾病。传统的活血化瘀型中药针对伴有“血瘀”“痰浊”“湿阻”等特征的高脂血症，具有“活血化瘀、滋阴化浊”的显著优势。国医大师张磊教授以运脾“汤运脾化积，消食导滞”治疗临床上诸多脾胃运化失司导致的病症，亦见于高脂血症的治疗，体现了中医学异病同治的辨证论治思想。本研究借助网络药理学的方法，初步挖掘、分析运脾汤治疗高脂血症的可能作用机制和物质基础。

本研究通过系统药理学的方法分析了运脾汤中11 味中草药的有效化学成分，及各化学成分与靶点的关系，128 个有效化学成分主要是木脂素和黄酮等几类化学物质。大部分化合物与关键靶点之间的相互作用经过分子对接验证，都具有较强的结合能力。通过对化合物与靶点的网络拓扑学分析，发现木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、柚皮素（naringenin）和川陈皮素（nobiletin）在网络中有较高的度值和中心性，说明这些化合物在网络中具有较重要的作用[9]。研究发现[10]，木犀草素可以通过与NPC1L1 结合直接抑制NPC1L1 的表达，发挥降低血液胆固醇的作用；并且抑制促炎性细胞因子TNF-α、IL-6的分泌，通过作用于TLR4/NF-κB信号通路发挥抗炎效应。木犀草素通过减少降低巨噬细胞中AMPKSIRT1信号传导的机制抑制LDL 受体缺陷小鼠的动脉粥样硬化[11]。槲皮素单独使用或作为铁络合物使用，可以防止脂肪堆积，并降低血糖、血脂，减轻肝脂肪变性和氧化应激反应[12]。山奈酚可以通过多种机制抑制蛋白激酶B（AKT）和SREBP-1 的活性，并对激活PPAR α 和PPAR δ，同时促进与脂肪酸氧化和肝细胞摄取脂肪有关基因的表达，从而降低血液中甘油三酯的水平[13]。柚皮素和川陈皮素属于柑桔类黄酮，柚皮素通过诱导肝脂肪酸（FA）的氧化和减弱FA 的合成，预防肝组织脂肪样变性、肝脏中极低密度脂蛋白（VLDL）的生成和高脂血症的形成，并减轻胰岛素抵抗、缓解脂肪组织扩张和炎症[14]。

表3 运脾汤作用高脂血症靶点的部分富集通路

图6 运脾汤对高脂血症作用靶点的GO功能富集分析柱状图

在靶点蛋白互作网络中，网络拓扑学分析参数显示，INS、IL6、VEGFA、PPARG、NOS3、EGFR、APOB 和ESR1 等靶点在网络中体现较高的连通特性，其在运脾汤治疗高脂血症的过程可能发挥较重要作用。分子对接结果显示，木犀草素、槲皮素、山奈酚、柚皮素、川陈皮素与NOS3、PPARG、APOB、ESR1、VEGFA 均有较强的结合活性，因此运脾汤可能是通过作用这些靶点对高脂血症发挥作用。研究发现，VEGFA 具有调节内皮细胞增殖，促进细胞迁移，抑制细胞凋亡并调节血管通透性的作用[15]，NOS3 可以产生一氧化氮（NO），其通过cGMP 介导的信号转导途径参与使血管平滑肌松弛，并介导冠状血管中VEGF 的血管生成[16]。PPARG是PPARs家族中最具脂肪细胞专一性的因子，是脂肪细胞分化和葡萄糖稳态的关键调节者[17]，可以通过结合过降血脂药和脂肪酸的核受体，调控过氧化物酶体脂肪酸β 的氧化途径，促进滋养细胞中中性脂质的积累以及游离脂肪酸的摄取，也增加了脂肪分化相关蛋白与脂肪酸转运蛋白的合成[18]。ESR1 在调节脂肪组织中的VEGFA 介导的血管生成具有重要作用[19]，可抑制血管平滑肌增殖和迁移，保护血管内皮的结构和功能，预防动脉脂质和复合糖类的形成[20]。

图7 运脾汤对高脂血症作用靶点KEGG通路富集分析气泡图

图8 运脾汤中HIF-1信号通路潜在靶基因的KEGG通路分析

图9 运脾汤干预高脂血症“中药材-有效化学成分-靶点-通路”综合网络图

运脾汤治疗高脂血症的关键靶点GO 功能富集显示，运脾汤可能通过药物反应、细胞内外刺激、脂多糖反应和反向调节凋亡等生物学过程来干预高脂血症；这些靶点主要位于膜筏、基底外侧质膜、顶体膜、细胞表面等处；具有抗氧化活性和酶结合等分子功能。KEGG 结果分析，运脾汤干预高脂血症的主要通过有HIF-1 信号通路、AGE-RAGE 信号通路、胰岛素信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路。HIF-1信号通路中的低氧诱导因子1（HIF-1），是一种转录因子，调节细胞在低氧环境下的反应，在过氧化物酶体脂质代谢的调节中起着关键作用[21]，HIF-1 通过激活肝组织中脂素lipin 1 的表达，从而导致活性氧的减少和防止肝脂质沉积[22]。AGE-RAGE 信号通路的激活能够通过调节NF-κB、VCAM-1 和炎性因子的产生，诱导炎症和氧化应激反应[23]。是众多糖脂代谢疾病如糖尿病、高胆固醇血症和动脉粥样硬化等高度相关的靶点信号通路[24]。胰岛素信号通路主要调节脂肪细胞中葡萄糖转运和脂肪分解，与胰岛素抵抗密切相关[25]。研究发现[26]，高脂血症在诱发动脉粥样硬化的过程中，炎症细胞因子，如VEGF 和TNF-α 会诱发血管血栓的形成，同时导致大量正常的细胞凋亡，加剧病情的发展。

综上所述，运脾汤中的多个有效化学成分能同时作用于2 个以上的靶点，并对应多条信号通路，在抗炎、氧化和诱导细胞凋亡等方面具有一定效果，体现了运脾汤从多靶点、多途径干预高脂血症的分子机制，主要作用为改善细胞代谢、调节血管活性和糖脂代谢等多个方面。并且对冠心病等心血管及糖尿病、胰岛素拮抗等内分泌系统疾病有着多重协同效应。网络药理学结合分子生物学、生物信息学等学科，本着整体性和动态性的特点，倡导多靶点、多途径的研究分析的思路与中医治疗的整体观念、辨证论治指导思想相符，也是目前研究中药作用机制较为全面的方法[27]。本研究预测了运脾汤干预高脂血症的物质基础和分子机制并挖掘潜在的作用靶点，为下一步深入实验验证奠定了理论基础和方向。