中草药提取物与抗菌药联用对耐药大肠杆菌的抑菌作用研究

郝 督，陈 琛，张小莺*

（1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中 723000）

从医学角度来看，大肠杆菌（E.coli）主要是一种存在于肝肠菌内的科埃希菌，从菌群性质上来看，属于革兰氏阴性无芽孢直杆菌，全身密布鞭毛，具有可活动性，无明显的芽孢（张炳亮等，2018）。大肠杆菌主要危害猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、兔等多种幼畜（禽）。从传染途径来看，消化道及呼吸道等都是大肠杆菌的直接传染途径，幼畜或者幼禽一旦发生感染往往具有急性特点，且有较高的致死率，常见的大肠杆菌病主要包括猪黄、白痢、雏鸡大肠杆菌等。

随着畜牧业快速发展，大肠杆菌病症日益凸显，抗菌药物发挥了无可替代的作用（高海涛等，2017）。但如果无节制的使用过量抗菌药物容易激发或扩散动物源设耐药病原菌，并引起药物残留和耐药性增加等附加问题，在人和动物间引起严重的耐药现象，严重阻碍临床治疗活动的开展。因此，寻找对大肠杆菌作用效果明显的中草药，研制出廉价高效的抗菌新药物对防治该病具有重要意义。

随着现代药理学的发展，在相关理论和技术支持下，大量植物源抑菌、抗菌化学成分和杀菌化等一系列具有较大开发潜力的化学成分被发现（纪晓宇等，2015；李仲兴等，2004），经过反复研究与实践发现，部分中草药联合其他抗菌药不但可以全面提升抗菌药自身抗菌活性，而且能在一定程度上有效限制耐药菌的生长（刘云宁等，2015）。

从传统中草药中提取天然化合物，拓展其应用范围，寻求替代抗菌药物对抗多重耐药菌已成为全球关注的热点问题（植婵萍等，2015），具有重大意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 黄连、夏枯草、茵陈、大青叶、甘草、山楂、女贞子、蒲公英、五倍子、艾叶采购于杨凌同康医药超市。硫酸庆大霉素粉末、硫酸大观霉素粉末；硫酸庆大霉素注射液；硫酸阿米卡星注射液；硫酸卡那霉素注射液，酵母提取物；胰蛋白胨；琼脂粉。

1.1.2 试验菌株 试验所采用的菌株主要是由西北农林科技大学相关实验室提供的标准大肠杆菌和耐药大肠杆菌。

1.1.3 实验仪器 RE-52AA型旋转蒸发仪；超声波清洗仪；SW-CJ-1D型超净工作台；电热恒温鼓风干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 中草药制剂的制备 以研磨器材粉碎所有药材，每种药材各取50 g，以高于药材10倍左右的蒸馏水进行为期24 h的浸泡，并采取超声技术对其进行破碎。经过静置沉淀后，将其中残渣进行过滤筛除，将药液以旋转蒸发仪进行浓缩，将其浓度控在1 g/mL，3000 r离心15 min，提取产生的清液，4℃储存。

1.2.2 抗菌药溶液的制备 大观霉素和庆大霉素粉末各40.96 mg，添加10 mL的蒸馏水进行溶解，使其溶液达到4096 μ g/mL，储存温度以4℃为最佳。将庆大霉素注射液、阿米卡星注射液、卡那霉素注射液浓度调至4096 μ g/mL，制备成储备液，4℃储存备用。

1.2.3 菌悬液的制备 以LB液体作为培养基，接种菌株，在温度恒定（37℃）的振荡培养箱有效培养，利用灭菌生理盐水调整菌液浊度，得到1.5×107～ 1.5×108CFU/mL的菌悬液（董自艳等，2014），备用。

1.2.4 中草药提取物的抑菌圈测定 采用牛津杯法（叶文初等，2016）测定中草药提取物的抑菌圈，主要判断依据分为低度敏感、中度敏感、高度敏感及极度敏感，具体标准如下：

低度敏感——抑菌圈直径＜10 mm；

中度敏感——抑菌圈直径在10～14 mm；

高度敏感——抑菌圈直径在15～19 mm；

极度敏感——抑菌圈直径≥20 mm。

1.2.5 试管两倍稀释法测定中草药、抗菌药对耐药大肠杆菌的最小抑菌浓度 依据临床和实验室标准协会相关标准，在测定中草药提取物或抗菌药单独抑菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度时可采用试管二倍稀释法（潘婕等，2015）。

1.2.6 中草药与抗菌药联用对耐药大肠杆菌微量抑制浓度指数测定 有效运用微量肉汤棋盘稀释法，在确保环境无菌性的情况下，按照96孔细胞培养板X轴、Y轴顺序依次稀释系列浓度的寒窑液体培养基（宋剑武，2014）。

表1 十种中草药提取物对大肠杆菌抑菌圈测定

2 结果与分析

2.1 抑菌试验测定结果 由表1可知，采用牛津杯法测定8种中草药煎液对大肠杆菌的敏感性，其中山楂、五倍子女贞子、夏枯草提取物对大肠杆菌的抑菌作用最强，为高度敏感，抑菌圈分别为20.4、22.8、15.1和 17.1 mm ；黄连、大青叶提取物对大肠杆菌的药物敏感性均表现为中度敏感；其余4种中草药提取物对大肠杆菌的抑菌作用均表现为低度敏感。

2.2 中草药提取物MIC测定结果 由表2可知，在大肠杆菌抑菌过程中，不同中草药提取物所产生的抑菌效果不尽相同，其中效果最为明显的是五倍子相关提取物。最低抑菌浓度值为31.25 mg/mL；抑菌效果最差的数茵陈，最低抑菌浓度值仅为125 mg/mL。

2.3 抗菌药MIC测定结果 由表3可知，氨基糖苷类不同抗菌药对大肠杆菌的抑菌效果不同，各抗菌药的MIC值存在一定差异，所选的4种抗菌药中，硫酸庆大霉素对大肠杆菌MIC值为8 μ g/mL，硫酸阿米卡星、硫酸卡那霉素的MIC值均为16 μ g/mL，而盐酸大观霉素比其他3种氨基糖苷类抗菌药对大肠杆菌有较弱的抑菌作用，MIC值高于 32 μ g/mL。

2.4 联合抑菌实验结果 由表4可知，中草药与抗菌药联合作用时，除山楂与硫酸大观霉素、五倍子与硫酸庆大霉素、女贞子与硫酸卡那霉素联合表现为协同作用外，大部分中草药与抗菌药组合表现为相加作用，少数组合出现拮抗作用和无关作用。

表2 十种中草药提取物对大肠杆菌MIC值测定

表3 抗菌药对大肠杆菌MIC值测定

表4 中草药联合抗菌药对大肠杆菌的体外联合抑菌结果

3 讨论

目前防治大肠杆菌病主要应用抗菌药，但抗菌药的过量使用会破坏肠道先天免疫力，引起菌群失调症，形成耐药菌株，从而加大防治难度。中草药作为中医、中兽医的重要一环，抗菌作用有着悠久的历史。根据近期相关研究资料显示，部分中草药确实具有抗菌、细菌耐药性延缓和消除等作用，不同于传统抗菌药，中草药内富含多种药效成分，其作用为多靶点形式，无较为显著的毒性特征，产生耐药性的可能性相对较低。中草药提取物不但能预防和抵抗大肠杆菌，且能有效促进动物生长，强化机体免疫力，有效抵抗各种疾病。周志远（2013）研究发现，联合应用黄芩、黄连、恩若沙星等能有效提升抑菌活性，且能在某种程度上实现对大肠杆菌耐药性的有效抑制。