不同根瘤菌接种对草原3号杂花苜蓿幼苗生长的影响

钱亚斯，石凤翎，闫 伟，乔 雨，张雨桐

(内蒙古农业大学草原与资源环境学院，草地资源教育部重点实验室， 农业农村部饲草栽培、加工与高效利用重点实验室， 内蒙古自治区草地管理与利用重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010019)

豆科植物根瘤菌(Rhizobium)的固氮作用，一方面能提高豆科植物的产量和品质，另一方面可有效提高土壤肥力，使后茬作物生长环境得到改善〔1〕。根瘤菌对豆科牧草生长发育有着重要作用，同时可改善土壤理化性质，提高土壤肥力〔2,3〕。豆科植物如缺少与之相匹配的根瘤菌株，则会降低对空气中氮气的利用,增加对土壤中化合氮的汲取,从而会降低土壤含氮量，导致土壤肥力衰退，造成植株生长缓慢〔4〕。

近几年，在甘农3号、公农1号、中苜1号等紫花苜蓿上做了相关苜蓿互接种族内根瘤菌接种效果的深入研究〔1,5,6〕，均表明通过接种与之相匹配的根瘤菌菌株，可显著提高其生产性能。但在草原3号杂花苜蓿上还未进行过相应的研究。草原3号杂花苜蓿在内蒙古地区具有较强的适应性，是该地区种植和推广的主要牧草。为提高其在不同环境下建植成苗率及牧草产量，通过对温室接种不同根瘤菌的草原3号杂花苜蓿幼苗的观察，以期获得对幼苗生长有促进作用的菌株，为草原3杂花苜蓿的高产栽培提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

1.1.1 根瘤菌采集地的地理位置

根瘤菌采集于4个地点，分别为内蒙古自治区土默特左旗沙尔沁基地(简称沙尔沁)(N40°34′54″,E111°46′54″，海拔1050m)、土默特左旗海流基地(简称海流)(N40°31′17″,E111°23′46″，海拔1008m)、呼和浩特市内蒙古农业大学(简称内农大)(N40°41′30″，E111°22′30″，海拔1055m)、达拉特旗关碾房(简称关碾房)(N40°19′7″，E109°59′52″，海拔1030m)。

1.1.2 采集地气候条件

4个采集地的气候条件接近，均属典型大陆性气候，年平均气温5.4℃，一月份最冷且极端最低气温-33.6℃，七月份最热且极端最高气温36℃；年均日照1600h；年平均降水400mm，多集中在7-9月份，冬季积雪少；无霜期113-134d，初霜期9月中下旬，终霜期5月末。

1.2 寄主植物材料

从北京克劳沃公司购买的苜蓿菌种，代号为DZ，其余均为自采，详见表2。

表1 各地点采集根瘤的寄主植物

1.3 试验方法

通过采集不同地区不同土壤条件下的苜蓿互接种族内的根瘤菌，进行纯化、鉴定及分类。将纯化后的根瘤菌与草原3杂花苜蓿接种，观察其幼苗生长状况。具体方法如下：

1.3.1 根瘤采集

在上述4个地点，于苜蓿属和草木樨属牧草生长的旺盛期(分枝期-现蕾)，选取健壮植株挖出根部，连同根际土壤一同装入塑封袋内，带回实验室后摘取其根瘤。

1.3.2 根瘤菌纯化鉴定

分离培养基(YEMA刚果红培养基)的配制，参考管凤贞等的方法〔7〕。将培养基与试验用具置121℃高压灭菌锅中灭菌20min；挑选大而有效的根瘤菌，用无菌水清洗3-4次。利用划线法将其接种到培养基上，置25℃恒温箱中培养。逐日观察直至筛选出不吸色的单一菌株。参照闫伟等〔8〕的鉴定结果，选取14个菌株进行以下的接种试验。

1.3.3 接种与幼苗培养

对纯化鉴定后的根瘤菌菌落，用无菌水配制OD600nm值大于0.5根瘤菌菌液，与草原3号杂花苜蓿种子进行拌种(浸泡露白后的发芽种子30min，浇灌3ml菌液)，播种于32穴育苗盘(高11cm、直径6cm)内的椰砖(灭菌的)上。播种后2周，按出苗数定量浇灌营养液〔1〕。

1.4 测试指标及方法

出苗后20d～49d每隔7d观察测定一次幼苗长势情况，包括绝对高度、叶片数、叶片宽。出苗后30d对各处理随机选取10株，测定单株根系有效根瘤菌个数、根瘤重量、地上生物量鲜重、根系鲜重、根系长。具体测定方法如下：

叶片数：数取单株上完全展开的叶片数量(片)。

幼苗高度：量取植株与地面垂直的最高处的绝对高度(cm)。

小叶的叶片宽：用游标卡尺量取复叶中间小叶叶面最宽处(cm)。

单株地上生物量鲜重：齐地面刈割后置千分之一天平称重(g)。

根瘤数及其重量：数取每一单株根瘤个数，然后置十万分之一天平称重(mg)。

根系长：量取根部最长的主根长度(cm)。

1.5 数据分析

采用Microsoft Excel 2007和SAS统计软件，对试验所得数据进行方差分析、聚类分析、相关分析等数理统计。

2 结果与分析

2.1 接种不同根瘤菌对草原3号杂花苜蓿幼苗地上部生长的影响

2.1.1 幼苗高度的变化

由图1可知，至第49d时，接种不同根瘤菌的草原3号杂花苜蓿幼苗高度有不同程度的差异。接种SJN、DZ、HK菌株的株高较对照略有变高，但显著高于接种XHC、SWL、SD、DK、XH的幼苗高度，反映出接种根瘤菌与不接种根瘤菌的草原3杂花苜蓿幼苗在株高上的变化不明显。

由表2可知，至49d时，接种不同根瘤菌的草原3号杂花苜蓿幼苗高度变幅有不同程度的差异。接种SJN、HH菌株幼苗株高变幅略大于对照，但显著高于接种H7、DC3、H2、XK、H8、SWL、XHC、DK及XH的幼苗；接种根瘤菌与不接种根瘤菌的草原3杂花苜蓿幼苗在株高变幅上的变化不明显。

表2 接种不同种根瘤菌草原3号杂花苜蓿幼苗株高变幅

注：不含相同的小写字母表示幼苗根瘤数之间差异显著(p<0.05)

2.1.2 幼苗叶片数的变化

由图2可知，接种SJN、HK菌株的幼苗其叶片数与CK及接种DK、XK、XH、XBC、H8、SWL菌种的幼苗叶片数存在显著差异，反映出接种根瘤菌与不接种根瘤菌的草原3杂花苜蓿幼苗在叶片数上的变化有显著作用。

由表3可知，至49d时，接种不同根瘤菌的草原3号杂花苜蓿幼苗叶片数变幅有不同程度的差异，接种SJN菌株的幼苗叶片数变幅显著高于对照及接种HK和DC3菌株的幼苗。

表3 接种不同种根瘤菌草原3号杂花苜蓿幼苗叶片数变幅

注：不含相同的小写字母表示幼苗根瘤数之间差异显著(p<0.05)

2.1.3 幼苗叶片宽度的变化

由表4可知，各菌种对其叶片宽度生长的影响存在一定的差异，其中接种SJN、DC3菌株的叶宽较对照略有变宽，但显著宽于H8、XH、HH菌株的接种效果；总体反映出接种根瘤菌与不接种根瘤菌的草原3杂花苜蓿幼苗在叶片宽度上的变化不明显。

接种草原3号杂花苜蓿幼苗地上生物量与CK有不同程度的差异。接种XHC、SJN菌株的地上生物量显著高于CK及其余菌株。其余菌种间以及与CK菌种间均无显著差异。

表4 接种不同种根瘤菌草原3号杂花苜蓿幼苗单株生物量和叶宽

注：不含相同的小写字母表示叶片宽之间差异显著(p<0.05)

2.2 接种不同种根瘤菌对草原3号杂花苜蓿幼苗根部生长的影响

由表5可知，接种不同种根瘤菌的草原3号杂花苜蓿幼苗的根瘤数、根瘤重量均与CK均有不同程度的差异，其中，接种HK的幼苗根瘤数显著高于CK及其余菌种；接种SJN、HK菌株的根瘤重量显著高于CK及XBC、SWL、SD、HH、H2、H7。

各菌种对其幼苗根系长度的影响存在一定的差异，其中接种SJN、HK菌株的根系长较对照略有增长，但显著高于H8、HH、XHC、XH、SD、SWL菌株的接种效果。总体反映出，接种根瘤菌与不接种根瘤菌的草接种不同根瘤菌草原3号杂花苜蓿幼苗的根系重量与CK均有不同程度的差异。其中DK、SJN菌种的根系重量显著高于CK及其余菌种。

表5 接种不同根瘤菌草原3号杂花苜蓿生长30d时根部生长情况

注：不含相同的小写字母表示幼苗根瘤数之间差异显著(p<0.05)

2.3 各指标的相关分析

由表6可知，株高、叶宽、生物量与根瘤重之间呈显著正相关，这表明根瘤重是促进幼苗生长的重要指标；根长、株高与根重之间也存在极显著或显著的正相关，根系越长越有利于植株吸收养分，促进幼苗的生长；株高与叶宽之间呈极显著的正相关，叶片宽度增加，增加了幼苗的光合作用，增加植株养分的积累，促进幼苗生长。

表6 各指标间的相关系数

注：*、**分别表示0.05和0.01显著水平

2.4 聚类分析

接种不同根瘤菌对草原3号杂花苜蓿幼苗生长起促进作用的指标有很多，对16个处理中的8个指标(株高、叶片数、叶宽、生物量、根长、根重、根瘤数、根瘤重)进行标准差标准化后，使用最长距离法聚为3类(图3)。

第一类：显著促进其幼苗生长的菌种为SJN、DZ、HK；第二类：各指标综合作用较好的菌种为H7；第三类：其余菌种无明显促进作用与CK聚为一类。

3 讨论

3.1 接种不同根瘤菌对地上造成的影响

高振生等〔9〕试验表明，接种根瘤菌可以提高植株生物学产量，但本试验结果与其不一致。在接种同种根瘤的处理中，部分菌株在叶片数、株高、叶宽及地上生物量上并未与CK之间产生的差异，可能与本试验采用无菌椰砖为基质有关，从而导致接种部分菌株的地上生物量与CK之间未产生差异；部分菌株作用可能表现在单一指标上，但在总体指标中未能发挥明显效果。

3.2 接种不同根瘤菌对结瘤的影响

由于受试验空间限制，未接种根瘤菌的植株长出根瘤菌，这与王作明等〔10〕研究结果一致。曾昭海等〔11〕研究，接种根瘤菌可提高植株幼苗时期的结瘤数，本试验的结果不一致。部分菌株接种后并未与CK之间产生差异，可能菌株与草原3号杂花苜蓿匹配能力不同，因而未产生差异。庞丹波〔12〕试验表明，接种根瘤菌可提高根瘤重量，本试验结果与其不一致，可能因单播、无其它作物之间的相互作用，进而导致试验结果有所差异。

在根瘤菌试验中，大多数的试验结果表明，根瘤菌数量是选择最佳匹配组合的重要指标〔6,12-15〕，但本试验结果也表明根瘤数与草原3号杂花苜蓿幼苗生长没有显著性，如HK结瘤数多，但生物量并没显著高于其它处理。这与潘佳等人〔1〕的试验结果相同。本试验结果表明根瘤重量与生物量之间存在显著相关，这说明根瘤菌重量是影响生物量的重要指标之一，这与刘旭艳等人〔16,17〕的试验结果相同。

3.3 接种不同根瘤菌根部的影响

本试验结果表明，幼苗高度与根长之间存在极显著相关，根长越长对土壤中的水分及养分吸收能力越强，对根瘤菌着生越有利，使其充分发挥作用，从而促进草原3号杂花苜蓿幼苗高度的生长。

3.4 根瘤菌结瘤影响

本试验中菌株H7、DC3来源于不同地区相同的寄主植物草原3号杂花苜蓿，但同一材料的菌株可能分属于两个属或同属内亲缘关系较远，这与闫伟等〔8〕研究结果相同，这可能与土壤环境等条件的差异有关，进而造成根瘤菌侵染寄主植物的能力不同。

本试验采用椰砖的试验方法检测根瘤菌与草原3号杂花苜蓿的匹配性，15株根瘤菌效果表现具有差异。这与管凤贞等〔7〕研究结果是一致的。根瘤菌的有效性与多种因素有关。相关研究表明根瘤的形成与根瘤菌和寄主植物交换调节信号有关，根部分泌类黄酮物质才能诱导结瘤基因结瘤。本试验所采用的培养基质椰砖，该基质可能是不能提供充足的微量元素来促进根瘤菌发挥其作用。

4 结论

从幼苗叶片数量、幼苗叶片宽以及幼苗的绝对高度、地上生物量以及根瘤的数量及其重量、根系长度及其重量均反映出，在15个苜蓿互接种族内的菌株中SJN、HK、DZ菌株接种草原3号杂花苜蓿的效果较好。