气相色谱法测定咸鸭蛋中的甲醇和乙醇

徐申锋 吴好 付瑞

摘要    本文建立了一種简便、快捷地测定咸鸭蛋中甲醇、乙醇的气相色谱方法。用乙腈提取咸鸭蛋中的甲醇和乙醇，用安捷伦HP-INNOWAX色谱柱（60 m×0.32 mm，0.25 μm）分离，用氢火焰离子化检测器检测。结果表明，甲醇和乙醇2种成分在5～500 μg/mL范围内线性显著，检测限分别为2.0、1.6 μg/g。甲醇回收率在94.88%～97.51%之间，乙醇回收率在97.03%～98.03%%之间，相对标准偏差小于5%。该方法可行性较强、灵敏度较好、操作简便、适用范围广，对试验基本设备的要求简单，可用于市售咸鸭蛋中甲醇、乙醇含量的检测。

关键词    咸鸭蛋;甲醇;乙醇;气相色谱法

中图分类号    O657.7+.1        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）04-0217-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    A gas chromatography method for the determination of methanol and ethanol in salted duck eggs was established in this paper.Methanol and ethanol in salted duck eggs were extracted with acetonitrile，separated on an Agilent HP-INNOWAX column（60 m×0.32 mm，0.25 μm），and detected by a hydrogen flame ionization detector.The results showed that the methanol and ethanol were linearly significant in the range of 5-500 μg/mL，and the detection limits were 2.0 and 1.6 μg/g，respectively.The methanol recovery rate was 94.88%-97.51%，the ethanol recovery rate was 97.03%-98.03%，and the relative standard deviation was less than 5%.This method has strong feasibility，good sensitivity，simple operation，wide application range，and simple requirements for the basic equipment of the experiment.It can be used to detect the methanol and ethanol content in salted duck eggs on the market.

Key words    salted duck egg;methanol;ethanol;gas chromatography

咸鸭蛋是一种色、香、味俱全的风味独特的膳食佳品，在全国各地均有生产，在其他地区如北美也占有一定市场[1]。其营养丰富，富含蛋白质、卵磷脂、维生素和矿物质等。咸鸭蛋在腌制的过程中，盐分侵入蛋内，蛋白质因发生盐析作用而变性凝固，将油脂从蛋白质组织中分离，煮熟后可以看到明显的出油现象[2]。利用磁共振成像技术可以清晰观察到腌制过程中的蛋黄凝胶化和蛋清脂类释放[3]。鸭蛋出油率高低是消费者评价咸鸭蛋品质的重要指标，相关的研究论文也多把出油率作为咸鸭蛋品质的评价指标[4]。

传统的咸鸭蛋腌制常采用自然渗透法，将新鲜鸭蛋洗净、晾干后在坛罐中腌制，或采用精盐泥包裹、浓盐水浸泡，一般密封后需放置30～45 d。为了提高出油率，需延长腌制时间或提高食盐用量。然而腌制时间过长易造成蛋白部分含盐量过高、蛋黄发灰，影响咸鸭蛋品质，同时随着腌制时间和盐浓度的增加，生、熟蛋清和蛋黄的含水量、弹性均呈下降趋势，影响口感[5-6]。因此，有大量研究通过物理、化学等方法，缩短腌制时间，加速成熟。如采用超声波腌制、对蛋壳表面进行酸处理、酸碱结合处理、在腌制剂中添加酒精等技术[7-9]。这些方法可以将腌制时间缩短，且增大咸鸭蛋出油率。其中，在腌制剂中添加食用酒精或白酒是最常用的方法，民间腌制咸鸭蛋也多采用此工艺，近年来申请的咸鸭蛋腌制类发明专利也多采用此种方法[10]。

然而，酒精中通常含有一定量的甲醇，被人体摄入后代谢为甲醛、甲酸，有很强的毒性，尤其对视神经损害严重，急性或慢性摄入过量的甲醇均会对视觉系统造成较大损伤[11-12]。甲醇在鸭蛋蛋白中的扩散速度大于乙醇，因而酒精中的微量甲醇极易在盐鸭蛋中富集。此外，可能存在一些不法商家使用工业酒精加工咸鸭蛋，产品中的甲醇含量将会更高。目前，针对咸鸭蛋中甲醇残留的研究较少，质控重点仍在胆固醇含量及色素残留等方面[13-15]。因此，有必要建立咸鸭蛋中甲醇和乙醇残留的检测方法，以用于咸鸭蛋质量控制。甲醇和乙醇测定方法主要有比色法[16]、近红外光谱法[17]、激光拉曼光谱法[18]、气相色谱法[19]等。对于食品中残留的痕量甲醇进行检测，气相色谱法最常用[20-21]。本研究采用乙腈提取咸鸭蛋中的甲醇和乙醇，进行气相色谱分离，建立咸鸭蛋中甲醇和乙醇快速测定方法，并用于市售咸鸭蛋样品的检测。

1    材料与方法

1.1    试验材料

样品：6种不同品牌不同地区的咸鸭蛋，产自高邮、广西、遵义，购自当地市场及网上商城。

仪器：气相色谱仪（Agilent 7890B，美国安捷伦科技有限公司），配氢火焰离子化检测器（FID）;分析天平（ME104，梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司）;无菌均质器（Scientz-IIL，宁波新芝生物科技股份有限公司）;高速离心机（3-18N，湖南恒诺仪器设备有限公司）;涡旋振荡器（VORTEX-5，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

试剂：甲醇（色谱纯）、乙醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、乙酸乙酯（分析纯）、丙酮（分析纯）、环己烷（≥99%）、异辛烷（>99%）、正己烷（>99%），均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2    试验方法

1.2.1    标准溶液配制。分别移取6.25 mL甲醇和6.25 mL乙醇溶液置于1 000 mL容量瓶中，加乙腈定容配成浓度为5 mg/mL的甲醇、乙醇标准混合液，待用。准确移取一定体积的上述混合标准溶液，采用乙腈稀释，配成500.0、250.0、100.0、50.0、25.0、10.0、5.0 mg/L甲醇、乙醇标准混合溶液。

1.2.2    样品前处理。咸鸭蛋去壳后在均质器上混合均匀，准确称取10 g置于50 mL离心管中。加入20 mL乙腈，在涡旋振荡器充分振荡1 min，静置5 min，6 000 r/min离心5 min，取上清液过滤后进样检测。

1.3    色谱条件

Agilent HP-INNOWAX色谱柱（0.32 mm×60 m，膜厚0.25 μm）;升温程序如下：初始柱温40 ℃，保持8 min;8～12 min，以5 ℃/min升至60 ℃;12.0～20.5 min，以20 ℃/min升温至230 ℃，保持2 min。进样口温度为230 ℃;检测器温度为250 ℃;载气为高纯氮气，流量为2.0 mL/min;进样口分流比：50∶1;进样体积：1.0 μL。

2    结果与分析

2.1    甲醇及乙醇提取条件的优化

分别采用乙酸乙酯、丙酮、乙腈、正己烷作为提取溶剂进行提取效率的比较，其中乙酸乙酯和正己烷的提取效率较差，回收率约25%，丙酮和乙腈均可有效提取甲醇，回收率>90%，然而丙酮中通常有甲醇残留，难以找到不含甲醇的空白溶剂，因而选取乙腈作為提取溶剂。

采用涡旋振荡的方式进行提取，分别充分振荡1、2、3、5、10 min，然后再分别静置5 min，离心后取上清液过滤上机分析。结果表明，不同的提取时间对回收率无显著影响，1 min的提取时间已经可以将甲醇和乙醇充分提取。因此，提取时间选择1 min。由于咸鸭蛋脂肪含量较高，在提取过程中易混入一定量的油脂。分别在2 mL乙腈提取液中加入0.5 mL正己烷、异辛烷、环己烷，考察其除脂效果。3种有机溶剂均可有效去除油脂层中的油脂，但同时均显著降低甲醇和乙醇的回收率。因此，选择不添加除脂溶剂，在离心后采用注射器吸取乙腈层进样分析。

2.2    标准曲线、线性范围、相关系数和检出限

将甲醇、乙醇标准混合液按1.3的色谱条件下依次进样测定，以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线并计算检出限（以3倍噪音值表示方法的检测限，对应浓度为最低检测浓度）为1 μg/mL，甲醇和乙醇的质量浓度与峰面积线性关系良好，线性方程分别为甲醇y=1.296 4x+0.658 3，相关系数为R2=0.999 9，乙醇y=1.760 9x+0.193 6，相关系数为R2=0.999 9。在此条件下，甲醇、乙醇标准混合液均能和干扰物完全进行基线分离，峰形较好，在短时间内达到了准确快速分析的目的（图1）。

2.3    精密度、重复性及回收率

2.3.1    精密度试验。精确吸取50.0 mg/L甲醇乙醇标准混溶液1 mL于1 mL样品瓶中，上机检测，重复试验6次，以峰面积计算相对标准偏差，甲醇为1.55%，乙醇为1.49%，精密度良好。

2.3.2    重复性试验。同一样品用乙腈提取，离心后检测，重复试验6次，以峰面积计算相对标准偏差，甲醇为1.02%，乙醇为2.59%，重复性良好。

2.3.3    回收率测定试验。取已测得甲醇、乙醇浓度的样品进行加标回收试验，加标水平分别为甲醇（15、30、75 μg/g）、乙醇（30、75、150 μg/g），上机检测，重复试验6次，计算样品的加标回收率和相对标准偏差，结果见表1。可以看出，甲醇回收率在94.88%～97.51%之间，乙醇回收率在97.03%～98.03%之间，相对标准偏差在2.20%～3.85%之间，回收率良好。

2.4    样品检测

将样品组按1.3的色谱条件下依次进样，测定结果如表2所示。结果显示，多数样品中均有乙醇检出，3种样品中无甲醇检出（ND，低于检出限）。有甲醇残留的样品中甲醇含量为17.9～38.3 mg/kg。由于目前没有咸鸭蛋中甲醇限量的国家标准，食用酒精国家标准中规定甲醇残留量不高于150 mg/L[22]，参考此标准，目前市场中的咸鸭蛋甲醇残留量均处于安全范围。

3    结论与讨论

利用气相色谱法首次建立了咸鸭蛋中甲醇和乙醇残留测定方法，并进行了方法学考察和实际样品的测定，该方法的可行性较强、灵敏度较好、操作简便、适用范围广，对试验基本设备的要求简单，可用于市售咸鸭蛋中甲醇、乙醇含量的检测。

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