5个毛果杨PtrZFP基因的鉴定和表达分析

李亚博 吕佳欣 谭 冰 高彩球

(东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040)

锌指蛋白(Zinc finger protein，ZFP)转录因子是植物中最大的转录因子家族之一。根据半胱氨酸(C)和组氨酸(H)残基的数目和位置可以将锌指蛋白转录因子分为C2H2、C4、C6、C8、C3HC4、C2HC、C2HC5、C4HC3、CCCH等9种不同类型。其中C2H2型锌指蛋白是数量最多、研究最为清楚的一类锌指蛋白，该类锌指蛋白大部分在锌指区具有植物中特有的“QALGGH”保守结构，可能涉及调控植物特有的生物学功能[1]。锌指区通过与靶分子DNA、RNA、DNA-RNA的序列特异性结合，以及与自身或其他锌指蛋白的结合，在转录和翻译水平上调控基因的表达[2～4]。

ZFP转录因子参与多种生物过程，包括转录调控，信号转导和形态发生以及生物和非生物应激反应。例如，一些植物ZFP转录因子与光信号转导有关[5]。拟南芥AtATL15基因显示出响应抗坏血酸(AsA)并在植物生长调节中发挥作用[6]。在辣椒中，CaRZFP1是可以被热诱导的C3HC4型ZFP家族转录因子，通过诱导其表达从而调控与生长有关的基因表达[7]。超表达CCCH型锌指蛋白基因AtZFP1可通过保持离子平衡，提高转基因植物抗氧化性，从而赋予其耐盐性。进一步研究表明AtZFP1可以调节一些应激相关基因的表达，如SOS1，AtP5CS1，KIN1，RD29B和RD22介导胁迫耐受性[8]。ZFP36是一种水稻C2H2型锌指蛋白，被发现可以调节晚期SOD和APX基因的表达增强了它们的活性，因此在抗氧化防御和氧化作用中发挥关键作用[8]。来自菊花的锌指基因BBX24，在调节开花时间方面起双重作用并且通过影响GA生物合成来影响植株对非生物胁迫的耐受性[9]。

研究发现，拟南芥AtZAT6蛋白可调节C2H2型锌指蛋白表达，广泛参与植物生长、发育和代谢，以及植物对低温、高盐和干旱等非生物逆境响应，拟南芥ZFP5基因通过直接调控ZFP8的表达来调节表皮毛发育[10]。水稻OsZFP1作为负调控因子，能抑制盐胁迫相关基因表达，降低转基因植株对盐胁迫抗性。同时，OsZFP1的逆境响应还受脱落酸(ABA)影响，暗示其可能参与ABA依赖的逆境响应过程[11]。

杨树是林木分子育种和基因工程研究的模式植物，并且是日常生活和生产中重要的用材树种，然而各种逆境环境严重影响了杨树的存活率和生长发育。因此通过对转录因子抗逆功能的挖掘，利用基因工程技术向杨树体内转入抗逆基因是杨树抗逆育种的有效途径。本研究从毛果杨中鉴定获得5条ZFP基因，对其序列特征和逆境胁迫后的表达模式进行分析，初步鉴定毛果杨ZFP基因是否参与抗逆胁迫应答反应，为研究和揭示林木逆境响应的分子机制提供理论基础，为杨树抗逆基因工程育种提供基因材料。

1 材料与方法

1.1 植物材料及处理方法

选取长势良好且一致的毛果杨组培苗，待生根苗长至5 cm左右时移栽到基质为3∶1(v/v)的草炭土和蛭石混合基质中，温室平均温度控制在25±1℃，光暗周期14 h/10 h，光强为400 μmol·m-2·s-1，适时浇水。待株高约为10 cm时进行胁迫处理。分别采用0.2 mol·L-1NaCl、15%聚乙二醇(PEG6000)和100 μmol·L-1脱落酸(ABA)根部浇灌处理，每48 h浇灌一次，同时浇水处理作为对照，每个处理重复3次。于处理6、12、24、48、72和144 h后，分别取各处理和对照毛果杨的根、茎、叶组织，立即放入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱中用于RNA提取。

1.2 毛果杨ZFP基因的生物信息学分析

从杨树基因组数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/)中获得5条ZFP转录因子氨基酸序列，利用ExPaSy在线Protparam软件(http://web/expasy/org/protparam/)分析获得ZFP蛋白的分子量和等电点等。利用在线软件GSDS2.0对ZFP基因的内含子和外显子结构进行分析，利用在线软件MEME对5个ZFP蛋白的保守结构域进行分析，同时对5条毛果杨ZFP基因的染色体定位情况进行研究。利用NCBI中的BLAST程序对获得的序列进行比对，搜索同源性高的其他3个物种的ZFP蛋白氨基酸序列，使用BioEdit对杨树ZFP转录因子蛋白序列进行比对分析。包括与胡杨(Populuseuphratica)、白杨(Populusalba)、巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)。从拟南芥基因组数据库(http://www.arabidopsis.org/)中得到132条ZFP基因的氨基酸序列，利用MEGA5.0进行系统发育进化树构建。利用ClustalX2.1和MEME对杨树ZFP转录因子蛋白序列进行基因保守元件(conserved motifs)的多元比较分析。

1.3 RNA提取和cDNA合成

利用PBIOZOL plant Total RNA试剂提取各处理材料的总RNA。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳评估提取RNA的完整性，并用Nanovue微型光度计检测其浓度。逆转录按照Prime ScriptTMRT reagents Kit(TAKALA)说明，两步法进行cDNA合成。反转录程序为42℃ 30 min，85℃ 6 min。将反转录产物稀释10倍后，-20℃冷冻保存备用。

1.4 实时荧光定量RT-PCR

选择毛果杨Actin基因为内参基因，根据5条PtrZFP基因和actin基因序列设计定量引物(表1)。以各处理和对照毛果杨的根、茎、叶cDNA为模板，用各基因定量引物进行qRT-PCR。qRT-PCR的反应体系为2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10.0 μL，10 μmol·L-1F和R引物各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，加水补至20.0 μL。采用2-ΔΔ(Ct)方法进行数据分析。其中，非胁迫处理(对照)表达水平设定为1。

表1 实时定量RT-PCR引物序列

Table 1 The primers sequences using in qRT-PCR

基因Gene引物Primer序列Sequence(5′→3′)ActinActin-FActin-RAGGTTATGCCCTTCCACACGAGGGCAACATACGCAZFP1ZFP1-DL-FZFP1-DL-RGCCAGTATTGTTTCAAGGAGAGAGCGTGAACTGATCAGGZFP2ZFP2-DL-FZFP2-DL-RAGGATGAAAGTCCGACGAGGCCTTGGTTATACACTTCCZFP3ZFP3-DL-FZFP3-DL-RGCTGAAGCAATACCACGAGTGTGGCCTTACTGGTTGTGZFP4ZFP4-DL-FZFP4-DL-RTCACGTACTACAGCTGAAGCCTATCCCTAGGGATCGGAATZFP5ZFP5-DL-FZFP5-DL-RGTCGCAAATAGTGAGCTCCTCGACTCGAGTTACTACTTGC

表2 毛果杨5个PtrZFP基因序列特征

图1 毛果杨ZFP家族外显子—内含子结构及保守motif分析Fig.1 Exon-intron structure and conserved motif analysis of ZFP genes

2 结果与分析

2.1 PtrZFP基因的获得及序列分析

通过查找，共获得5条毛果杨PtrZFP基因。进一步序列分析发现这5个基因具有完整的开放读码框，因此推测为全长基因，命名为PtrZFP1-5。5个PtrZFP蛋白都至少具有一个典型的锌指蛋白结构域。其中，PtrZFP2和PtrZFP5属于CCCH类型，其他3个PtrZFP转录因子均属于C2H2类型。这5个PtrZFP基因编码蛋白推测的氨基酸残基数为258～338 aa，预测的分子质量数为27.7～37.3 kDa，理论等电点为4.87～8.61(表2)。预测PtrZFP1定位于细胞外周质，PtrZFP2定位于细胞质，而PtrZFP3-5定位于细胞外膜(表2)。DNA结构分析发现，PtrZFP2和PtrZFP5分别包含1或2个内含子序列，其他转录因子没有内含子序列(图1)。此外，PtrZFP2和PtrZFP5的motif基序数目多于其他转录因子(图1)。基因在染色体上的定位结果显示，5条基因不均匀的分布在3条染色体上，其中4号染色体上1条，10号和17号染色体上各两条(图2)。

利用NCBI搜索毛果杨ZFP转录因子的同源序列，选择与其同源性较高的3种植物进行同源性分析和多序列比对。多序列比对结果显示，PtrZFP2和PtrZFP5不包含C2H2型锌指蛋白的保守结构域，不属于C2H2型锌指蛋白(图3)。PtrZFP1、PtrZFP3、PtrZFP4与其他三个物种相似度较高，并且包含C2H2型锌指蛋白的保守结构序列“QALGGH”，属于典型的C2H2类锌指蛋白。

图2 毛果杨ZFP基因在染色体上的定位Fig.2 Localization of ZFP genes of Populuson chromosome

图3 ZFP氨基酸序列多序列比对Fig.3 The multiple sequence alignment of ZFP genes

图4 ZFP蛋白的系统进化树Fig.4 The evolutionary tree analysis of PtrZFP with Arabidopsis thaliana ZFP proteins

为进一步分析毛果杨ZFP蛋白的进化关系，将查找获得的132个拟南芥ZFP基因与5个毛果杨ZFP基因进行进化树分析(图4)。聚类分析结果表明，拟南芥ZFP蛋白可分为13组，而5个PtrZFP蛋白分为2个亚组：Ⅰ和Ⅻ。其中，Ⅰ类是较大的亚组属于C2H2类蛋白，3个PtrZFP蛋白，即ZFP1、ZFP3和ZFP4归为该组；而ZFP2和ZFP5属于Ⅻ类亚组，均属于CCCH类蛋白。

2.2 毛果杨PtrZFP基因应答逆境胁迫表达模式分析

为了初步了解毛果杨PtrZFP1-5基因的功能，利用qRT-PCR技术分析了这5个PtrZFP基因在盐、干旱和ABA胁迫下毛果杨根、茎、叶中的表达特征。

2.2.1 NaCl胁迫下毛果杨ZFP家族基因表达模式分析

根中，5个PtrZFP基因都至少在2～3个研究时间点明显被上调或下调表达，其中PtrZFP1的表达量在盐胁迫早期(6 h)就被明显诱导(为对照的4.02倍)。PtrZFP2和PtrZFP5基因在24 h内对盐胁迫产生显著响应，均在24 h达到最高表达水平(分别为对照的8.08和4.88倍)。

茎中，盐胁迫后，PtrZFP2，3和5在所研究的6个时间点的表达量变化都不明显(表达量变化在0.5～2.0)。而PtrZFP1和PtrZFP4在所有胁迫时间点都表现为上调表达，且在一半以上的时间点，被盐胁迫明显诱导。最高表达水平均出现在盐胁迫144 h，分别为对照的7.55和5.24倍。而在胁迫初期(6 h)，表达量即达到一个较高水平，分别达到对照的4.15和3.98倍。

叶中，PtrZFP1的表达与根和茎类似，在所有时间点都上调表达，144 h表达量为对照的6.77倍。同样PtrZFP3也与茎中相似，对盐胁迫无明显应答。而PtrZFP2，4，5在叶中的表达模式与茎明显不同。尤其是PtrZFP2，其在叶中表达在所有时间点都受抑制，且绝大部分时间点抑制效果明显。PtrZFP4除胁迫48 h表达量差异明显，其余时间点都无明显应答。而PtrZFP5在绝大部分时间点表达被抑制。

图5 NaCl胁迫处理下毛果杨ZFP基因表达模式Fig.5 Expression analysis of ZFP genes in response to NaCl

图6 PEG6000胁迫处理下毛果杨ZFP基因表达模式Fig.6 Expression analysis of ZFP genes in response to PEG6000

图7 ABA胁迫处理下毛果杨ZFP基因表达模式Fig.7 Expression analysis of ZFP genes in response to ABA

2.2.2 聚乙二醇(PEG6000)胁迫下毛果杨ZFP家族基因表达模式分析

根中，PtrZFP1、PtrZFP3和PtrZFP4能够明显被渗透胁迫(PEG处理)诱导表达，且均在48h达到表达量的峰值，分别为对照的7.64、6.08和6.60倍。PtrZFP2和PtrZFP5在整个胁迫过程中表达量变化相对较小，在胁迫前期(6 h)为下调表达，分别为对照的47%和53%，随后表达量上调，胁迫24 h时表达量最高，为对照的2.48和2.74倍，随后基本恢复到正常水平。

茎中，PtrZFP1-5与根中的表达模式相同，PtrZFP1、PtrZFP3和PtrZFP4表达明显被上调，且在胁迫72 h时差异最明显，分别为对照的5.44、3.58和2.98倍。PtrZFP2和PtrZFP5在胁迫前期(6 h)为下调表达，分别为对照的46%和61%，随后被上调表达，胁迫48 h时表达量最高，为对照的2.53和2.74倍。

叶中，表达模式与根和茎中明显不同。PtrZFP1在所有胁迫时间点均上调表达外，PtrZFP2主要表现为下调表达，在胁迫早期(6 h)其表达就被迅速抑制，表达量仅为正常水平的19%，72 h及以前PtrZFP2基因均为明显下调表达，而144 h表达恢复到正常水平。而PtrZFP3，4和5在所有研究的时间点表达量均无明显改变(除PtrZFP5在胁迫72 h被下调表达)。

2.2.3 脱落酸(ABA)处理下毛果杨ZFP家族基因表达模式分析

根中，PtrZFP1、PtrZFP3、PtrZFP5的表达整体上发生了明显改变，主要为上调表达。分别在24、72和48 h时表达量达到最高水平，分别为对照的4.08、3.64和2.5倍。而PtrZFP2和PtrZFP4在ABA处理后，表达量无明显变化。

茎中，PtrZFP1在ABA处理前期(48 h)均做出比较明显的响应，处理6 h时，表达量是对照的2.56倍。PtrZFP2在处理前期与非胁迫处理无明显差异，但在处理12～144 h时间内，PtrZFP2基因处于下调水平，48 h到达最低水平，仅为非处理的18%。而PtrZFP3，4和5的表达除个别时间点(1个时间点)发生了明显改变外，绝大部分时间点的表达量与对照相比，差异不明显。

叶中，PtrZFP1和3的表达没有受到ABA处理的明显影响。而PtrZFP2基因在所有被研究的时间点均为下调表达，处理48 h时PtrZFP2基因表达量水平最低，为对照组的21%。PtrZFP5基因在ABA处理时也主要被抑制表达，48 h时表达量达最低(为对照组的17%)。PtrZFP4基因在ABA处理前期，表达量变化不明显，而后期发生了明显改变。

3 讨论

本研究从毛果杨中克隆获得了5条ZFP基因，其中PtrZFP2和PtrZFP5属于CCCH类型，PtrZFP1、PtrZFP3和PtrZFP4属于C2H2类型。植物C2H2类锌指蛋白能对靶向DNA进行识别[1]。Dathan等研究发现拟南芥SUPERMAN基因可对靶DNA进行独立的转录调节[12]。迄今在矮牵牛(Petuniahybridavilm)中总共发现了30多个C2H2型锌指蛋白，锌指区都含有“QALGGH”的保守序列，这些锌指蛋白被称为矮牵牛EPF锌指家族[13]。其中7个锌指蛋白主要在花药中表达，5个为特异表达，可能参与花药发育调节[14]。植物C2H2锌指蛋白除了参与植物的生长发育外，也可能与植物逆境胁迫相关[1]。拟南芥STZ是第一个被证明同盐胁迫有关的转录因子，它在调控与耐盐性有关的下游基因的表达中可能起关键作用[15]。Sakamoto等发现AZF2可能是参与依赖于ABA的信号途径的调节因子，另外还发现AZF2在拟南芥受到盐胁迫时的根部大量表达，推测其参与调控盐胁迫下与根生长有关的基因表达[16]。

与C2H2型锌指蛋白相似，CCCH型锌指蛋白也能参与植物的生长发育并受到不同胁迫的诱导[17]。Sun等发现AtSZF1和AtSZF2在拟南芥中负调控盐胁迫相关基因的表达[18]。Li等在1998年发现拟南芥的一个锌指蛋白PEI1参与了心胚的形成过程[19]。CsSEF1基因编码参与黄瓜体细胞胚胎发育过程[20]。在拟南芥中发现的SOMNUS蛋白，对光依赖种子发芽的下游蛋白起负调控作用[21]。OsLIC则控制水稻叶片和分蘖角度影响水稻结构进而影响稻谷产量[22]。

为了初步了解毛果杨ZFP基因的功能，利用qRT-PCR技术分析了这5条ZFP基因在毛果杨受盐、干旱和ABA等胁迫处理后的表达情况。表达模式分析表明，PtrZFP1-5基因都能至少在一个器官中对盐、旱以及ABA胁迫处理做出应答。其中，在高盐、干旱和ABA3种胁迫处理后，PtrZFP1基因在根、茎、叶中均为上调表达，表明该基因可能能参与这3种胁迫应答。而PtrZFP2基因在高盐、渗透和ABA胁迫后，在叶中的表达明显被抑制，表明该基因可能在叶中发挥功能。而PtrZFP3基因在受到干旱胁迫时在根中的响应最为明显，高盐和ABA处理条件下在根、茎、叶中的表达与对照相比差异较小，推测该基因特异性在干旱胁迫后根中起作用。PtrZFP5基因在经受高盐和ABA胁迫后，在叶中主要表现为下调。表明该基因发挥作用的器官可能是叶中，参与叶中ABA信号途径的盐胁迫应答。在后续研究中我们将进一步对这些PtrZFP基因在毛果杨逆境胁迫应答过程中的具体功能和机制进行分析。