一测多评法同时测定百合固金片中9种成分含量

陈海燕，刘华东，李冰，覃佩莉

(1.广西卫生职业技术学院，南宁 530023；2.广西白云山盈康药业有限公司，南宁 530023)

百合固金片由玄参、地黄、熟地黄、白芍、百合等10味中药材按处方工艺加工而成，具有养阴润肺、化痰止咳功效，主要用于肺肾阴虚、燥咳少痰、痰中带血、咽干喉痛等症的治疗。现代研究表明，百合固金制剂治疗特发性肺纤维化疗效明显[1]，对肺癌具有减轻临床症状、提高化疗效果、减轻化疗毒副作用、增加化疗敏感性、改善生活质量等特点[2]，该药联合左氧氟沙星治疗社区获得性肺炎不仅可以改善临床症状，还可降低机体炎症反应[3]；联合N-乙酰半胱氨酸能改善慢性阻塞性肺疾病稳定期患者临床症状及肺功能[4]。百合固金片收载于《中华人民共和国药典》2015年版一部[5]，标准中仅对佐药白芍所含芍药苷的含量进行了测定，笔者仅检索到对该制剂所含芍药苷进行检测的文献[6]。单一成分难以有效控制中成药复方制剂质量均一性，多指标评价模式已广泛应用于中成药复方制剂的质量控制，但普通的多指标评价模式在实验过程中所用对照品用量大，部分对照品存在不稳定、价格昂贵等因素；一测多评法(quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS)利用百合固金片所测各成分间内在函数关系和比例关系，建立各成分间的相对校正因子，通过测定一个易得、价格低廉成分的对照品实现多个成分的同步测定。笔者在本实验采用一测多评法，以芍药苷为参照，建立其与哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷的相对校正因子，同步测定君药地黄和熟地黄3种成分梓醇、毛蕊花糖苷和焦地黄苯乙醇苷B1，臣药玄参2种成分哈巴苷和哈巴俄苷，佐药白芍4种成分氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和苯甲酰芍药苷含量，并与外标法进行对比，较全面地控制百合固金片质量，以期为提高百合固金片质量控制方法提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪，配备G1314A 可变波长检测器(美国安捷伦公司)，Waters E2695型高效液相色谱仪，配备2998可变波长检测器(美国Waters公司)；色谱柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) 、Waters Sunfire C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) 和Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；BP211D型电子天平(德国Sartorius公司，感量：0.1 mg)；SB52000型超声波清洗器(宁波新芝生物科技有限公司)。

1.2试药 哈巴苷对照品(批号：111729-201707，含量：96.8%)、哈巴俄苷对照品(批号：111730-201709，含量：95.9%)、梓醇对照品(批号：110808-201711，含量：99.6%)、毛蕊花糖苷对照品(批号：111530-201713，含量：92.5%)和芍药苷对照品(批号：110736-201842，含量：97.4%)均来源于中国食品药品检定研究院；焦地黄苯乙醇苷B1对照品(批号：120406-37-3，含量：98.0%)来源于成都普瑞法科技开发有限公司；氧化芍药苷对照品(批号：39011-91-1，含量：98.0%)来源于成都曼思特生物科技有限公司；芍药内酯苷对照品(批号：39011-90-0，含量：98.0%)和苯甲酰芍药苷对照品(批号：38642-49-8，含量：98.0%)来源于上海纯优生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯；百合固金片(规格：每片0.45 g，批号：180102，180301，180402)来源于广东万方制药有限公司。

2 方法与结果

2.1色谱条件 采用Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相A：乙腈，流动相B：0.2%磷酸溶液，梯度洗脱(0～15.0 min，19.0%A；>15.0～24.0 min，19.0%A→25.0%A；>24.0～37.0 min，25.0%A→29.0%A；>37.0～53.0 min，29.0%A→41.0%A；>53.0～60.0 min，41.0%A→19.0%A)；0～29.0 min时在210 nm[5，7-12]波长下检测哈巴苷、哈巴俄苷和梓醇，29.0～37.0 min在330 nm[10-11]波长下检测毛蕊花糖苷和焦地黄苯乙醇苷B1，37.0～60.0 min时在230 nm[5-6，13-16]波长下检测氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷；流量0.9 mL·min-1；柱温25 ℃；进样量10 μL。在上述色谱条件下，理论板数按所测各色谱峰计均大于3 500，9种成分与相邻峰分离度均>1.5。

2.2混合对照品溶液的制备 分别精密称取哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷对照品适量，用稀乙醇分别制成9种单成分对照品储备液(哈巴苷0.858 mg·mL-1、哈巴俄苷0.294 mg·mL-1、梓醇3.792 mg·mL-1、毛蕊花糖苷1.936 mg·mL-1、焦地黄苯乙醇苷B10.712 mg·mL-1、氧化芍药苷0.376 mg·mL-1、芍药内酯苷1.318 mg·mL-1、芍药苷2.552 mg·mL-1、苯甲酰芍药苷0.214 mg·mL-1)；再依次精密吸取单成分对照品储备液各适量，用稀乙醇制成每毫升含哈巴苷0.042 9 mg、哈巴俄苷0.014 7 mg、梓醇0.189 6 mg、毛蕊花糖苷0.096 8 mg、焦地黄苯乙醇苷B10.035 6 mg、氧化芍药苷0.018 8 mg、芍药内酯苷0.065 9 mg、芍药苷0.127 6 mg、苯甲酰芍药苷 0.010 7 mg混合对照品溶液。

2.3百合固金片供试品溶液的制备 取百合固金片适量，除去薄膜衣，研成细粉，取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL[5-6]，称定质量，SB52000型超声波清洗器超声(功率：200 W，频率：40 kHz)提取30 min，放冷，用稀乙醇补足损失质量，摇匀，滤过，续滤液即得百合固金片供试品溶液。

2.4阴性样品溶液的制备 按照《中华人民共和国药典》2015年版一部百合固金片的处方和制备工艺，分别制备不含地黄和熟地黄的阴性样品、不含玄参的阴性样品、不含白芍的阴性样品，再按照“2.3”项方法分别制备3种阴性样品溶液。

2.5专属性考察 取混合对照品溶液、百合固金片供试品溶液、地黄和熟地黄阴性样品溶液、玄参阴性样品溶液和白芍阴性样品溶液适量，在上述色谱条件下进样测定，记录色谱图，见图1。由图1可知，百合固金片供试品溶液所测成分哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷色谱峰保留时间和对照品溶液中所测各成分的保留时间一致，其他成分对测定无干扰，阴性样品对测定无干扰。

2.6线性范围实验 分别精密吸取“2.2”项哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷9种单成分对照品储备液各2.0 mL，置于同一20 mL量瓶，采用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，作为混合标液Ⅰ；再精密吸取混合标液Ⅰ各适量，依次用稀乙醇稀释2，4，8，16，20倍，制成混合标液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。依次精密吸取混合标液Ⅵ、Ⅴ、Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ各适量，进样检测，记录哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷9种成分色谱峰的峰面积，以哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷质量浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷9种单成分的回归方程，结果见表1。

2.7精密度实验 取“2.2”项混合对照品溶液进行测定，连续进样6次，记录哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷的峰面积，结果所测各成分峰面积的RSD分别为0.83%，1.07%，0.51%，0.34%，0.75%，0.91%，0.65%，0.60%和1.18%(n=6)。

2.8重复性实验 取同一批次百合固金片适量，按照“2.3”项百合固金片供试品溶液制备方法制备供试品溶液6份，进样测定，记录哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷的峰面积，计算所测各成分的含量，结果所测9种成分含量的RSD分别为1.54%，0.71%，0.87%，0.96%，1.39%，1.67%，0.25%，1.06%和0.89%(n=6)。

2.9稳定性实验 取同一批次百合固金片的同一份供试品溶液，室温下放置，在上述色谱条件下0，2，4，8，16，24 h分别进样检测，记录哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷的峰面积，结果百合固金片供试品溶液室温下24 h内稳定，所测各成分峰面积的RSD分别为0.77%，1.06%，0.53%，0.61%，0.78%，1.03%，0.62%，0.58%和1.14%(n=6)。

2.10加样回收率实验 取已知含量的同一批次百合固金片6份，研成细粉，每份约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入另行配制的0.639 mg·mL-1哈巴苷对照品溶液、0.198 mg·mL-1哈巴俄苷对照品溶液、2.195 mg·mL-1梓醇对照品溶液、1.317 mg·mL-1毛蕊花糖苷对照品溶液、0.552 mg·mL-1焦地黄苯乙醇苷B1对照品溶液、0.261 mg·mL-1氧化芍药苷对照品溶液、0.969 mg·mL-1芍药内酯苷对照品溶液、1.937 mg·mL-1芍药苷对照品溶液和0.141 mg·mL-1苯甲酰芍药苷对照品溶液各1.0 mL，精密加入稀乙醇16 mL，按照“2.3”项方法制备加样供试品溶液，依次进样测定，结果所测成分哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷的平均加样回收率分别为98.92%，97.96%，99.73%，99.03%，97.78%，97.29%，98.69%，100.12%和96.94%，RSD分别为0.97%，1.30%，1.11%，0.85%，1.25%，1.02%，0.98%，0.78%和1.51%(n=6)。

A.混合对照品；B.百合固金片供试品；C.玄参阴性样品；D.地黄熟地黄阴性样品；E.白芍阴性样品；1.哈巴苷；2.哈巴俄苷；3.梓醇；4.毛蕊花糖苷；5.焦地黄苯乙醇苷B1；6.氧化芍药苷；7.芍药内酯苷；8.芍药苷；9.苯甲酰芍药苷。

图1 5种样品的HPLC色谱图

A.mixed reference substance；B.sample ofBaiheGujinTablet；C.negative sample ofScrophulariaeRadix；D.negative sample ofRehmanniaeRadixandRehmanniaeRadixPraeparata；E.negative sample ofPaeoniaeRadixAlba；1.harpagide； 2.harpagoside；3.catalpol；4.verbascoside；5.jionoside B1；6.oxypaeoniflorin； 7.albiflorin；8.paeoniflorin；9.benzoylpaeoniflorin.

Fig.1HPLCchromatogramoffivekindsofsample

表1 百合固金片中9种成分的线性关系

Table.1LinearrelationshipofninecomponentsinBaiheGujinTablet

成分线性方程线性范围/(μg·mL-1)r哈巴苷A=7.239 1×105C-919.34.29～85.800.999 3哈巴俄苷A=8.991 4×105C+453.01.47～29.400.999 2梓醇A=1.000 6×106C-829.718.96～379.200.999 5毛蕊花糖苷A=1.124 2×106C+317.09.68～193.600.999 3焦地黄苯乙醇苷B1A=6.864 9×105C+724.83.56～71.200.999 1氧化芍药苷A=1.011 0×106C-350.41.88～37.600.999 6芍药内酯苷A=5.911 9×105C+148.66.59～131.800.999 4芍药苷A=1.303 4×106C-869.312.76～255.200.999 1苯甲酰芍药苷A=9.220 5×105C+413.41.07～21.400.999 3

2.11相对校正因子的计算 相对校正因子的计算公式k/s=(CkAs)/(CsAk)(式中C为所测各成分质量浓度，A为所测各成分峰面积，k为其他成分，s为参照成分)。精密吸取“2.6”项混合标液Ⅵ、Ⅴ、Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ，依法进样检测，记录各成分色谱峰峰面积，以芍药苷为参照，分别计算哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷的相对校正因子，结果见表2。

2.12待测成分相对校正因子耐用性考察 在Agilent 1100型高效液相色谱仪、Waters E2695型高效液相色谱仪2种高效液相色谱仪上，分别考察本色谱条件在Diamonsil C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)、Waters Sunfire C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)和Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)3种色谱柱上的相对校正因子值，结果见表3。

表2 以芍药苷为参照的相对校正因子

表3 不同色谱柱对相对校正因子的影响

2.13待测成分色谱峰的定位 采用相对保留值法对所测各成分色谱峰进行定位，以芍药苷为参照，考察所测成分哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷在2种高效液相色谱仪(Agilent 1100型高效液相色谱仪、Waters E2695型高效液相色谱仪)和3种不同品牌色谱柱(Diamonsil C18柱、Waters Sunfire C18柱和Agilent Eclipse XDB-C18柱)条件下与参照成分芍药苷的相对保留值，结果见表4。实验结果表明2种高效液相色谱仪和不同品牌色谱柱条件下所测成分相对保留值无明显差异。

2.14外标法与一测多评法测定结果比较 取3批百合固金片样品(批号：180102，180301，180402)适量，按照“2.3”项方法制备供试品溶液，依法进样测定哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷的峰面积，分别采用外标法和一测多评法计算哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷的含量，结果见表5。

3 讨论

3.1指标成分的选择 百合固金片由玄参、地黄、熟地黄、白芍、百合等10味中药材加工而成，方中地黄、熟地黄滋阴养血、清热凉血，百合甘苦微寒、滋阴清热、润肺止咳，三药共为君药；方中玄参咸寒，助二地滋阴壮水，以清虚火，麦冬甘寒，助君药滋阴清热、润肺止咳，共为臣药；方中当归、白芍养血和血，川贝母润肺止咳化痰，桔梗载药上行、清利咽喉、化痰散结，共为佐药；方中甘草调和诸药，为使药。笔者选取百合固金片君药地黄和熟地黄所含主要成分梓醇、毛蕊花糖苷和焦地黄苯乙醇苷B1，臣药玄参所含特征成分哈巴苷和哈巴俄苷，佐药白芍所含主要成分氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和苯甲酰芍药苷为考察指标，采用QAMS建立百合固金片的含量测定方法，从而更加全面科学地控制百合固金片的质量。

3.2流动相的考察 笔者在本实验中考察了不同流动相体系(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液[9]、乙腈-0.1%磷酸溶液[5，10，13，15]、乙腈-0.2%磷酸溶液[11，14])对所测定成分哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷峰形、出峰时间、分离度等指标的影响，通过摸索，最终采用乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)作为流动相按照文中的梯度洗脱比例，对百合固金片所含哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷进行同时测定。

表4 不同色谱柱对相对保留值的影响

表5 百合固金片中9种成分含量测定结果

Table.5ResultsofcontentdeterminationonninecomponentsinBaiheGujinTabletmg·g-1

批号芍药苷外标法哈巴苷外标法QAMS哈巴俄苷外标法QAMS梓醇外标法QAMS毛蕊花糖苷外标法QAMS1801021.9420.6410.6380.2020.2042.2162.2231.3221.3171803011.7490.6720.6660.2310.2291.9982.0051.1911.1961804022.2220.5500.5540.1740.1762.3202.3131.5181.513批号焦地黄苯乙醇苷B1外标法QAMS氧化芍药苷外标法QAMS芍药内酯苷外标法QAMS苯甲酰芍药苷外标法QAMS1801020.5490.5550.2570.2600.9740.9790.1430.1451803010.4690.4720.2910.2940.8790.8830.1230.1201804020.6270.6240.2200.2221.1141.1090.1620.163

笔者在本实验建立的QAMS同时测定百合固金片中哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷的含量，方法便捷、准确度好、精密度高，可作为该制剂的有效质量控制方法。