银翘散对流感病毒感染性重症肺炎小鼠肺组织的修复机制研究*

王 佳，冯星火，国丽娜，王 妍

1.辽宁省人民医院重症医学科(沈阳 110000)；2.沈阳市第六人民医院(沈阳 110006)

流感是临床最常见和多发的急性呼吸系统传染病，若不给予有效的治疗干预，极易引起重症肺炎[1]。流感病毒感染所致重症肺炎主要表现为患者的肺部发生弥漫性损伤，且病情进展迅猛，治疗难度较大，死亡率高[2]。目前西医对流感病毒感染所致重症肺炎的治疗方式主要为扩张支气管、抗炎、抗感染、祛痰及机械通气等综合治疗，但疗效并不理想[3]。近年来中医在治疗重症肺炎中越来越多被应用，并具有较佳的疗效[4]。重症肺炎患者会存在肺泡细胞及肺血管内皮等损伤，极易发展为急性呼吸窘迫综合征，急性免疫损伤是流感病毒所致重症肺炎患者死亡的主要原因，因此有必要针对肺损伤加强肺保护。本文通过对流感病毒感染重症肺炎小鼠给予银翘散治疗，为中医治疗的作用机制提供有益的方法和探索思路。

资料与方法

1 材 料 选用BALB/cAnN 小白鼠60 只，(动物批准号：SCXK(京)2018-0021)60只，体重16～22 g，由中国医学科学院动物研究所提供，饲养于清洁级实验室中(室温20°C～24°C，湿度40%～60%)观察3 d后，用于实验。

2 主要仪器与试剂 离心机(型号：5424r、美国Eppendorf 公司)、电子天平(型号：YP3001、常州市宏衡电子仪器制造)、切片机(型号：HM340E、德国LEICA公司)、全自动酶标仪(型号：Read Max 1900Plus，厂家：上海闪谱生物科技有限公司)、紫外分析仪(型号：UV-2000、上海科学仪器厂生产)、显微镜(型号：Olympus IX71，厂家：日本OLYMPUS)、电泳槽(型号：Bio-RaD，厂家：美国Bio-Rad公司)。

兔抗人NF-κB多克隆抗体(西安海宁生物工程有限公司)、Western blot及凝胶电泳试剂均购于南京凯基生物有限公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(上海碧云天生物技术有限公司)、IL-6、IL-1、TNF-α试剂盒均由北京美迪科生物技术有限公司提供， H1N1流感病毒(军事医学科学院微生物与流行病研究所免疫室提供)。银翘散液制作：连翘、金银花各30 g，薄荷、桔梗、牛蒡子各18 g，淡豆豉15 g，桑白皮、荆芥穗、大黄、甘草各 12 g，胆南星、地骨皮、苦杏仁、瓜蒌子各 10 g。蒸馏水煎煮3次，过滤、浓缩至含生药2.5 g/ml，高压灭菌后-4℃保存待用。

3 分组、模型制备及干预 将60只健康小鼠随机分模型组(对照组)及治疗组(观察组)，各30只，两组小鼠给予乙醚轻度麻醉，给予25 μl H1N1流感病毒滴鼻感染，感染量为1LD50。感染30 min后，对照组每日给予6 ml生理盐水灌胃，观察组给予银翘散液灌胃，剂量为20 g/kg，每日2次灌胃(每次蒸馏水稀释至3 ml)，连续7 d。

4 观察指标

4.1 肺组织形态学观察：两组小鼠感染7 d后，分别取10只，处死取其肺组织，其中一部分切成1 mm3大小，0.3 %戊二醛和1 %的四氧化锇进行固定，梯度丙酮脱水进行树脂包埋，切片(厚度4 μm)经HE染色后，光镜观察并进行肺组织病理半定量评分，按照0～3分法对应病理改变程度(0分为正常，1分为轻度、2分为中度、3分为重度)分别从气道粘膜上皮细胞脱落程度、毛细血管淤血程度、肺泡腔纤维蛋白渗出程度、中性粒细胞渗出程度、肺泡间隔增宽程度5个方面进行评分，最低分为 0分，最高分为 15分。

4.2 Western-blot法检测肺组织NF-κB表达：两组小鼠感染3、5、7 d后，取10只，处死，取其肺组织标本，采用改良异硫氰酸胍法提取肺组织总蛋白，取40 μg总蛋白，溶入等体积的缓冲液中煮沸10 min，经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离蛋白；将蛋白质转印到硝酸纤维素膜(NC膜)上；20℃下，NC膜置入封闭液中振荡封闭30 min，漂洗3次，加入NF-κB抗体(1∶1000稀释)，脱脂奶粉封闭孵育过夜。加入二抗(1∶500)，孵育1 h，使用TBS洗膜3次，采用免疫荧光增强法检测NF-κB蛋白的表达。

4.3 炎症因子检测：两组小鼠感染3、5、7 d后，取10只处死，将肺组织标本制作成组织匀浆，冰氯化钠溶液(2℃左右)漂洗后，离心机(3000 r/min)离心10 min，取上清，采用ELISA法检测IL-6、IL-1、TNF-α水平，按照相关试剂盒说明书进行操作，酶标仪(波长450 nm)读取OD值，并计算出IL-6、IL-1、TNF-α浓度。

4.4 肺W/D、TLW检测：两组小鼠感染7 d后，处死取右肺上叶组织，生理盐水漂洗表面残留血液，滤纸吸干后，进行称重，记为湿重(W)，烤箱烘烤24 h(80 ℃)后，再次称重，记为干重(D)，计算肺组织湿干比(W/D)=湿重/干重×100%；肺总肺水含量(TLW)的计算标准：TLW=(W-D)/D。

结 果

1 两组小鼠肺组织形态情况 病理结果显示，对照组小鼠的肺泡结构破坏严重，肺泡间隔明显增宽，气管上皮脱落，大量炎性细胞渗出，肺组织毛细血管淤血(图1)。观察组肺组织病理变化明显改善，炎细胞浸润减少， 肺泡间隔基本恢复正常，呈现出损伤及损伤后修复的形态学变化(图2)。

2 两组小鼠NF-κB及炎症因子表达情况 干预治疗3、5、7 d后，观察组NF-κB表达水平明显低于对照组，IL-6、IL-1、TNF-α的浓度明显低于对照组(P<0.05)，见表1～4。

3 两组小鼠肺组织W/D、TLW情况及病理评分情况 观察组W/D、TLW及病理评分明显低于对照组(P<0.05)，见表5。

表1 两组小鼠不同时间NF-κB蛋白相对表达量

注：与对照组比较，*P<0.05

表2 两组小鼠不同时间IL-6水平情况(pg/ml)

注：与对照组比较，*P<0.05

表3 两组小鼠不同时间IL-1水平情况(μg/ml)

注：与对照组比较，*P<0.05

表4 两组小鼠不同时间TNF-α水平情况(ng/L)

注：与对照组比较，*P<0.05

表5 两组大鼠的W/D、TLW及病理评分比较

注：与对照组比较，*P<0.05

讨 论

流感病毒不仅是导致流行性感冒的主要病原体之一，也是导致呼吸道感染性疾病的主要病原体，也是重症肺炎的重要感染病原体[5]。重症肺炎以肺部损害为主，并伴发多种器官功能衰竭，患者死亡率较高[6]。西医主要通过扩张支气管、抗感染、祛痰及营养支持等综合治疗，其疗效存在一定局限性。我国传统中医认为，流感属于“外感热病”范畴，重症肺炎属于“肺闭”、“喘咳”等范畴[7-10]，其发病机制为疫毒蕴结，耗气伤津，热邪外侵，先侵犯肺脏，肺气郁闭，形成血瘀，肺失宣肃，治疗原则以活血化瘀，宣肺止咳为主[11]。

银翘散药方最早出现在清代，其主要由金银花、连翘、桔梗、甘草、薄荷、牛蒡子等多味中药组成，具有清热解毒，宣肺止咳的功效[12-15]。其中连翘和金银花具有疏散风热，清热解毒的功效；薄荷和牛蒡子具有疏散风热，辛凉宣散的功效；桔梗具有止咳利咽，开宣肺气的功效，甘草可调和药性，并可利咽止咳[16-19]。流感病毒感染所致重症肺炎的发病机制十分的复杂，其中持续的炎症反应是导致患者重症的主要原因，患者预后与炎症反应密切相关，控制病毒感染引起的持续不可控的炎症反应是降低患者死亡率的关键[20]。TNF-α是机体最早产生的炎症介质，可诱发和放大炎症反应[21]。IL-6会诱导炎症细胞黏附、聚集，导致肺血管的通透性増加，引起肺间质水肿[22]。IL-1是一种促炎性细胞因子，在局部起免疫调节作用，可参与损伤的肺泡上皮的修复[23]。NF-κB是一种重要炎症介质，炎症反应的起始阶段起促进作用[24]。本研究结果显示，干预治疗3、5、7 d后，观察组NF-κB表达水平明显低于对照组， IL-6、IL-1、TNF-α的浓度明显低于对照组，这是可能是因为银翘散中的金银花具有广谱的抗菌作用，对各种病菌有较强的抑制作用，对流感病毒等病源微生物也具有较强的抑制作用，可有效抑制流感病毒对肺部的损伤[25-28]。现代药理论学认为，连翘具有抗微生物的作用，具有显著抗炎作用，并可抗肝损伤。甘草中甘草甜素可对流感病毒进行直接的清除，并增加机体免疫能力，参与机体免疫应答，减轻机体的免疫病理损伤[29-30]。肺泡上皮损伤会激活炎性反应网络，引起肺的炎症反应。通过对小鼠给予银翘散干预治疗，可有效解除流感病所致重症肺炎的气滞血瘀状态，通过抑制相关炎症因子，降低肺泡毛细血管的通透性，对肺部炎性渗出、出血及水肿等产生缓解作用，减轻肺泡-毛细血管屏障的损伤，促进肺损伤的修复，因此W/D和TLW及半定量病理评分也随之降低。

综上所述，银翘散可对流感病毒感染所致重症肺炎具有良好的干预效果，可通过调节各种炎症因子水平，达到修复免疫病理损伤的目的，对流感病毒感染所致重症肺炎的中医治疗具有重要的指导意义。