冠心病合并代谢综合征患者固醇调节元件结合蛋白表达水平与脂代谢指标相关性研究*

王亚平，彭春艳，朱名安

1．锦州医科大学研究生院(锦州121000)；2．湖北医药学院附属太和医院检验科(十堰442000)； 3．湖北医药学院附属人民医院检验科(十堰 442000)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary artery disease，CAD)简称冠心病，是最常见的心血管疾病[1]。代谢综合征(Metabolic syndrome,MS)是心血管疾病及糖尿病等相关危险因素的综合体，这些因素包括脂代谢紊乱、血糖异常、血压升高和内脏肥胖，也被认为是CAD发生及发展过程中的独立危险因素[2]。许多临床研究表明，MS能增加CAD发生的相对风险，提高患者的病死率[3]。同时，MS患者中风和CAD的风险比正常人增加了3倍[4-5]。因此，对CAD合并MS患者的危险因素的早期检测已经变得越来越重要。固醇调节元件结合蛋白(Sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs)是一类重要的转录因子，主要调节脂肪酸和胆固醇代谢关键基因，对维持脂质平衡十分关键[6]。一般来说，SREBP-1激活脂肪酸和甘油三酯的合成，而SREBP-2则增加胆固醇的合成[7]。在本研究中，我们以SREBPs为切入点，联合MS的高危因素，进行CAD合并MS的相关性研究，为其早期筛查及诊断提供理论支持。

资料与方法

1 一般资料 收集2017年12月至2018年11月在湖北医药学院附属太和医院心内科住院的CAD患者，根据患者是否同时合并MS，将其分为CAD合并MS组和CAD组。冠心病的诊断依据参照患者的冠状动脉造影结果。MS的诊断标准参照中华医学会糖尿病学分会(CDS，2004)基础上修订的诊断标准[8]。病例排除标准：①心脏器质性疾病如先天性心脏病等；②肝肾功能严重损害如尿毒症等；③严重的全身感染性疾病；④使用免疫抑制剂或化疗药物。最终纳入CAD组70例和CAD合并MS组73例。在体检中心收集以年龄、性别匹配，血管造影正常的同期健康个体作为对照组，共159例。所有研究对象均已签署书面知情同意书。使用SYNTAX网页(www.syntaxscore.com)对CAD合并MS患者的造影结果进行评分：低危组0～22分，中危组23～32分，高危组≥33分。本研究把0～22分作为低风险组，共28例；≥ 33分作为高风险组，共45例。

2 研究方法

2.1 生化指标检测：抽取晨间空腹12 h静脉血，离心后取血清进行15个生物学标志物的检测。脂质代谢标志物：总胆固醇(Total cholesterol，TC)，甘油三酯(Triglycerides，TG)，高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)，低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)，载脂蛋白A1(Apolipoprotein A1，Apo-A1)，载脂蛋白B(ApolipoproteinB，Apo-B)，脂蛋白a[Lipoprotein a，LP(a)]。心肌酶标志物：肌酸激酶(Creatine kinase，CK)，肌酸激酶-MB(Creatine kinase-MB，CK-MB)，乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)，羟丁酸脱氢酶(Hydroxybutyratedehydrogenase，HBDH)。炎症标志物：高敏C-反应蛋白(High-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)。蛋白质代谢标志物：同型半胱氨酸(Homocysteine，HCY)。肾功能标志物：胱抑素-C(Cystatin C，Cys-C)。葡萄糖代谢标记物：糖化血清蛋白(Glycated Serum Protein，GSP)。所有样本在-80℃保存，仅使用时解冻一次。所有生化指标均在湖北医药学院附属太和医院检验科中心实验室通过标准技术检测。

2.2 外周血白细胞SREBPs相对表达水平检测：Trizol法提取细胞总RNA，测定RNA浓度及纯度。取1 μg总RNA逆转录为cDNA，随后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR反应。引物序列：引物序列：SREBP-1上、下游引物：5’-TGCATTTTCTGACACGCTTC-3’；5’- CCAAGCTGTACAGGCTCTCC-3’；SREBP-2上、下游引物：5’- TGGCTTCTCTCCCTACTCCA-3’，5’- GAGAGGCACAGGAAGGTGAG-3’；内参GAPDH上、下游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’,5’- GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’；反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性10 s，62℃退火34 s，72℃延伸1 min 40个循环(Bio-Rad公司CFX96)。结果分析计算采用2-△△ct。

结 果

1 三组研究对象的一般资料比较 与对照组相比，CAD组和CAD合并MS组的年龄和性别比较差异无统计学意义(P均> 0.05)；CAD组TC、HDL-C、LDL-C、Apo-A1、Apo-B和GSP水平降低(P均< 0.05)，LP(a)、CK和hs-CRP水平升高(P均< 0.05)；CAD合并MS组TC、HDL-C和CK降低(P均< 0.001)，TG、LP(a)、AST、CK-MB、HBDH、hs-CRP和GSP水平升高(P均< 0.05)。与CAD组相比，CAD合并MS组TG、LDL-C、Apo-B、AST和GSP水平升高(P均< 0.05)。见表1。

表1三组研究对象的一般资料比较

注：P1为对照组与单纯冠心病组比较；P2为对照组与CAD合并MS组比较；P3为单纯冠心病组与CAD合并MS组比较

2 外周血白细胞SREBPs mRNA的相对表达水平 与对照组相比，CAD组外周血白细胞SREBP-1mRNA和SREBP-2 mRNA相对表达水平无明显变化(P>0.05)；CAD合并MS组外周血白细胞SREBP-1mRNA相对表达水平显著降低(P<0.001)，SREBP-2mRNA相对表达水平差异比较无统计学意义(P>0.05)。与CAD组相比，CAD合并MS组SREBP-1mRNA相对表达水平显著降低(P<0.05)，SREBP-2mRNA相对表达水平比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见图1。

图1 外周血白细胞SREBPsmRNA相对表达水平

3 外周血白细胞SREBP-1mRNA水平与各生化指标相关性分析 通过对外周血白细胞SREBP-1 mRNA水平和各生化指标进行相关性分析得出：在所有样本中(n=302)，SREBP-1mRNA水平与血清中TC、HDL-C、Apo-A1、CysC的含量呈正相关，与血清中hs-CRP、CK-MB、HCY的含量呈负相关(P均<0.05)；在疾病组样本中(n=143)，SREBP-1mRNA水平与血清中HDL-C、GSP的含量呈正相关，与血清中HCY、hs-CRP的含量呈负相关(P均< 0.05)。见表2。

表2SREBP-1水平与各生化指标的相关性分析

4 多因素Logistic回归分析 在多因素Logistic回归模型中校正相关危险因素后，分析结果显示，SREBP-1表达水平是CAD合并MS的潜在风险因素[优势比(OR)= 0.346，95%可信区间(CI)=(0.191～0.625)，P<0.001]，且可能受到血脂，血糖，高血压等危险因素的影响。见表3。

表3SREBP-1相对表达水平与CAD合并MS风险因素分析

5 SREBP-1表达水平在CAD合并MS患者的诊断价值 用SPSS做低风险组和高风险组的SREBP-1表达水平ROC曲线，同时用SREBP-1分别与血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C、Apo-A1、Apo-B)联合做ROC曲线分析，见表4。SREBP-1单独预测CAD合并MS严重程度指标时，灵敏度较高但特异度较低[AUC为0.627(0.492～0.763)，敏感性=75%，特异度=53.5%，P=0.069]；联合HDL-C后AUC面积及特异度明显升高，灵敏度较高[AUC为0.640(0.507～0.774)，敏感性=50%，特异度=77.8%，P=0.045]；联合Apo-A1后AUC面积及特异度明显升高，灵敏度较高[AUC为0.648(0.479～0.751)，敏感性=60.7%，特异度=75.6%，P=0.034]。

表4外周血白细胞SREBP-1表达水平预测CAD合并MS危险程度

讨 论

2016年发布的《心脏病和卒中统计数据》指出，心血管疾病是影响人类健康主要医疗问题，CAD仍然是造成世界人民健康问题的主要因素[9]。MS是CAD的极高危因素。许多流行病学调查结果表明，MS患者合并CAD的风险是普通人群的3倍[10]。MS的患病率在健康人群中为22%，在CAD患者中则为41%，合并MS的CAD患者有更高的冠状动脉病变风险，这增加了心血管疾病发病率和病死率[11-12]。脂质代谢异常是MS中的重要组成部分，参与CAD的发生和发展[13]。固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)是调控一系列脂质代谢稳态的重要转录因子，本研究中我们通过检测外周血白细胞SREBPs的表达水平，联合脂代谢相关指标共同探讨其在CAD合并MS中的作用机制。

SREBPs是一类具有碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链结构的核转录因子，调节维持细胞脂质稳态所需基因的表达[14]。SREBPs的转录激活需要与SREBP切割活化蛋白(SCAP)结合，将SREBPs不活跃的前体从内质网转到高尔基体，然后迁移到细胞核与靶基因启动子区的甾醇反应元件结合，从而调节基因转录[15]。在哺乳动物中包含SREBP-1和SREBP-2两种类型的基因，SREBP-1主要参与脂肪酸和胆固醇合成，SREBP-2调控胆固醇合成和摄取，它们在功能上既有交叉但也相互独立。本研究发现与对照组和单纯冠心病组相比，CAD合并MS患者外周血白细胞SREBP-1 mRNA 表达水平均显著降低，SREBP-2 mRNA 表达水平无明显变化。有学者通过采用代谢和脂质组学分析测定动脉粥样硬化小鼠的血清样本，发现致动脉粥样硬化饮食在早期阶段(8周)小鼠心脏中SREBP-1的水平升高；16周后无明显变化；在连续喂养至25周后，SREBP-1表达呈下降趋势。这说明SREBP-1在动脉粥样硬化的发展过程具有波动性，在动脉粥样硬化早期SREBP-1可发挥正常的调控功能，随着动脉粥样硬化程度的加重，SREBP-1表达水平下降。这与我们研究中CAD合并MS组中SREBP-1的表达水平变化相一致。以上结果显示，SREBP-1的表达水平下降与动脉粥样硬化严重程度及脂代谢紊乱有关。SREBP-2与胆固醇代谢的调节密切相关并受到细胞内胆固醇水平的调控。与对照组和CAD组相比，CAD合并MS患者外周血白细胞SREBP-2 mRNA 表达水平无明显变化，这可能与CAD合并MS患者服用他汀类药物有关。他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原酶活性，使胆固醇的合成减少，从而维持血清胆固醇水平处于正常参考范围内相对低的水平。

脂质代谢紊乱通常是指TG和(或)LDL-C水平升高，和(或)HDL-C水平降低。有研究发现CAD危险系数随血浆TG水平的升高而增加，MS患者通常由于吸收胆固醇少而合成胆固醇增多，导致TG和Apo-B增高。当摄取LDL-C能力超过巨噬细胞清除氧化LDL-C的能力时，可导致LDL-C累积及泡沫细胞坏死，释放出大量溶酶体酶，引起细胞坏死，促进冠状动脉硬化的发生和发展。相较于对照组和CAD组，CAD合并MS患者中血清TG、LDL-C、Apo-B、AST和GSP升高，这表明CAD合并MS群体中血脂代谢水平更为紊乱，且以血清TG 和LDL-C水平升高为主要表现。作为脂质代谢和胰岛素抵抗相关基因转录调控的重要激活因子，SREBP-1的下调可能与血清TG、LDL-C、Apo-B、AST和GSP紊乱有关；脂类的积累可能阻止了SREBP-SCAP复合物的易位和断裂，破坏了脂质的稳态，这是一个基于自我调节的反馈过程。此外，Logistic回归分析评估SREBP-1 mRNA水平降低与CAD合并MS风险增加的关系，发现SREBP-1表达水平降低是CAD合并MS的一个潜在危险因素，且与高脂血症、糖尿病、高血压等有关，这表明SREBP-1可能通过调控糖尿病、高脂血症、高血压等疾病通路来参与CAD合并MS的发病，未来仍需大规模的样本进行进一步验证。

通过对外周血白细胞SREBP-1mRNA水平和CAD传统危险指标进行相关性分析得出：在所有样本中，SREBP-1mRNA水平与血清中TC、HDL-C、Apo-A1、CysC的含量呈正相关，与血清中hs-CRP、CK-MB、HCY的含量呈负相关；在疾病组样本中，SREBP-1mRNA水平与血清中HDL-C、GSP的含量呈正相关，与血清中HCY、hs-CRP的含量呈负相关。说明了SREBP-1与脂代谢及胰岛素抵抗等CAD传统危险因素有关，它们之间的相互作用可能造成心血管疾病发病率的增加。

此外，我们进一步评估了外周血白细胞SREBP-1表达水平在CAD合并MS患者的诊断价值，我们发现单独用SREBP-1预测CAD合并MS严重程度指标时，灵敏度较高但特异度较低；当联合HDL-C或Apo-A1预测诊断后，特异度明显升高但灵敏度较低。可见，CAD合并MS患者外周血SREBP-1表达水平降低可导致其血浆多种指标水平升高，联合多种血脂指标检测的准确性可能优于单一指标检测，这有可能成为CAD及其高危患者筛选和诊断的新策略。

综上所述，SREBP-1在联系CAD与MS之间起到了桥梁作用，并提示外周血白细胞SREBP-1mRNA水平是CAD患者合并MS的潜在危险因素，SREBP-1 可能是CAD患者合并MS重要的生物学标记物。本实验也存在一定的局限性：比如样本量少，研究对象只在鄂西北人群中进行，未进行SREBPs蛋白水平检测等等。这些不足将会在接下来的研究中进行完善。