响应面法降低肝细胞冷冻保护液中的二甲基亚砜浓度

邱冠宇， 李维杰， 刘宝林

上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093

细胞冻存是细胞保存技术之一。使用这种技术可以使细胞暂时脱离生长状态而保存细胞特性，这样在需要的时候可随时复苏细胞用于实验。同时适度地保存一定量细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢失，起到了细胞保种的作用。细胞的低温保存有2种方法:慢速冷却法与玻璃化保存法[1]，这2种方法都需要添加低温保护剂[2]。二甲基亚砜(Me2SO，DMSO)是一种重要的渗透型细胞保护剂。在超低温保存细胞时使用DMSO冷冻保护剂，可以有效地防止细胞内液生成冰晶、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤。DMSO能够快速穿透细胞膜从而进入细胞内部，通过降低胞内水的冰点来延缓细胞的冻存过程。同时也能通过提高细胞内离子浓度, 来降低细胞内冰晶的形成数量，从而减少细胞损伤。DMSO是目前应用最为广泛的细胞保护剂之一[3-13]。

目前在细胞的冷冻保存方面，最常用的DMSO浓度为10%，能够起到有效的保护作用，但有研究表明 DMSO 存在严重的毒副作用，它可与细胞内的蛋白巯基基团发生作用，导致蛋白质变性，对肝细胞膜造成损害[14-15]。有文献表明, 当DMSO≥0.8%时，随着浓度的增加以及作用时间的延长，DMSO对RPMI8226 细胞的增殖抑制作用逐渐增强，呈浓度-时间依赖性关系(P<0.05)，且在荧光显微镜下可观察到凋亡细胞[16]。因此，在肝细胞低温冷冻保存的过程中，应尽量降低DMSO的浓度，以达到减少DMSO毒性对肝细胞损害的目的。

原发性肝癌已经成为全球常见恶性肿瘤，肝细胞癌(hepatocellulareareinoma, HCC)是原发性肝脏恶性肿瘤中的最主要类型，在我国的发病率居所有恶性肿瘤的第4位，死亡率居第3位[17-18]。因此对肝细胞研究具有重要的意义。本研究以肝细胞作为保存对象，以响应面法设计不同浓度的DMSO、甘油、海藻糖制成的混合冷冻保护剂对肝细胞进行冷冻保存来探究最佳的配比，以期降低DMSO的浓度，同时进一步提高细胞的存活率。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

实验材料：人肝细胞(购于上海生物细胞研究所)。

实验试剂：二甲基亚砜(Me2SO，德国APPLICHEM公司)；海藻糖、甘油(国药集团化学试剂有限公司)；RPMI-1640培养液(GIBCO公司);台盼蓝染色液(碧云天生物技术公司);胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1保护剂配置 按表1所示进行复合保护剂的配置。

表1 响应面试验设计因素及水平Table 1 Design factor and horizontal coding of response surface methodology

1.2.2肝细胞处理 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化，吹打后将细胞移至15 mL离心管中(1 000 r·min-1，4 min)。离心结束后吸弃胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀。将细胞分装入冻存管中，每管1.0～1.5 mL。

1.2.3肝细胞冻存 将装有细胞的冻存管放入-4 ℃冰箱2 h，然后放入-80 ℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内放置24 h。

1.2.4细胞复苏 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37 ℃温水中震荡约2 min。从37 ℃水浴中取出冻存管，将吸出细胞悬液转移到离心管中离心(1 000 r·min-1，4 min)。

1.2.5细胞存活率的计算 取制成的细胞悬液，用台盼蓝染色的方法[19]测定肝细胞存活率。具体方法是：取细胞液和台盼蓝染色剂，以4∶1的比例在小试管中混匀，静置3 min，取适量用血球计数板进行计数，分别计数活细胞与死细胞数量来确定细胞存活率。

1.3 数据处理

利用Design Expert 8.0.6软件进行数据处理，以确定最佳保护剂配比。

2 结果与分析

2.1 响应面法优化冷冻保护剂配比

根据表1 选定的响应面考察因素和水平，通过Box-Behnken方法设计得到 17 组试验，具体方案及结果见表2。细胞复温存活率为56.74%～84.35%不等，基本符合预期，证明3种保护剂配比设计是合适的。其中8组存活率较高，10组存活率较低。

2.2 模型建立与方差分析

利用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行分析，得到肝细胞存活率(Y)与各因素之间的二次多元回归拟合方程为：

Y=+80.25+2.78 A-0.66B+8.28C+3.24AB+4.33AC+0.50BC-4.92A2-8.70B2-5.18C2

由表3得知，该二次多项模型显著，Adeq Precision(精密度)=30.197>4，表明该模型是可用的，足以拟合出试验结果。实验方法较可靠，决定系数R2=0.992 0，说明该回归方差模型拟合度较好。在该方差分析中，F值体现各单因素对肝细胞存活率影响的大小，F值越大，提取效果越好，从表中可以看出C>A>B，即对肝细胞存活率的影响因素中，海藻糖的影响最大，其次是DMSO，影响最小的是甘油。

表 2 响应面试验设计方案及结果Table 2 The experimental design and results for response surface methodology

2.3 响应面分析

响应面法有着正交试验所不具备的特点，它可以给出直观的图形，考察2个因素之间的交互作用对肝细胞存活率的影响[20]。等高线图为鞍马或椭圆形时，表示两者交互作用较显著。另外，响应面图中曲面的陡峭程度能直接反映单因素对该响应值存活率影响的大小。

如图1所示，交互作用DMSO和甘油浓度的等高线呈椭圆形，说明两者交互作用显著。从响应曲面图可以看出，在A(DMSO浓度)为4%的水平和B(甘油浓度)为6%的水平上，提取效果最好。

如图2所示，交互作用DMSO和海藻糖浓度的等高线呈椭圆形，说明两者交互作用显著。从响应曲面图可以看出，在A(DMSO浓度)为4%的水平和C(海藻糖浓度)为0.2%的水平上，提取效果最好。

表3 二次响应面回归模型方差分析 Table 3 Variance analysis of quadratic respoase surface regression model

注：**表示差异在P<0.01水平上具有统计学意义。

如图3所示，甘油和海藻糖浓度的等高线呈椭圆形，说明两者交互作用显著。从响应曲面图可以看出，在B(甘油浓度)为6%的水平和C(海藻糖浓度)为0.2%的水平上，提取效果最好。

2.4 验证试验

经响应面试验，最终优化出的保护剂配方参数为：DMSO浓度3%，甘油浓度6%，海藻糖浓度0.1%。该配比下肝细胞存活率的预测值为84.35%。并在该配比条件下进行3次重复实验，得到的存活率为81.36%。结果表明，响应面可行性良好，优化出的工艺条件有效。

图1 DMSO和甘油浓度对肝细胞复活率影响的响应面图及等高线图Fig.1 Response surface and contour plots of DMSO and glycerol concentrations on hepatocyte reactivation rate

图2 DMSO和海藻糖浓度对肝细胞复活率影响的响应面图及等高线图Fig.2 Response surface and contour plots of DMSO and trehalose concentrations on hepatocyte reactivation rate

图3 甘油和海藻糖浓度对肝细胞复活率影响的响应面图及等高线图Fig.3 Response surface and contour plots of glycerol and trehalose concentrations on hepatocyte reactivation rate

3 讨论

本试验通过响应面法优化冷冻保护剂中3种试剂浓度的配比，以肝细胞复温存活率为响应值进行了分析。结果表明3种因素对复温肝细胞存活率依次为海藻糖、DMSO、甘油。且得出的最佳工艺参数为DMSO浓度3%，甘油浓度6%，海藻糖浓度0.1%。在此条件下3次重复实验得出的值与预测值较为接近，方法较可靠。由此可见，该工艺条件有效地降低了DMSO的浓度，减少了由此带来的对肝细胞造成的毒性损害，为后续的研究奠定了基础。

本实验提供了细胞外DMSO的合适浓度，但由于DMSO是一种渗透性保护剂，至于冻存之后在细胞内产生了多少DMSO的残留，还需要进一步的实验进行确定；其次，有关于海藻糖的浓度是否还有细化的空间也需进一步探究。在之前实验过程中发现，大于0.3%浓度的海藻糖会由于保护液的渗透压太大，从而在冻存前使肝细胞全部死亡，因此对海藻糖的浓度有待更深层次的研究。最后，希望通过本实验结果，能够提示在其他类别的细胞冻存中也降低DMSO毒性的危害，同时积极去寻找新型的无毒保护剂，来逐步替代毒性保护剂。