基于ITS2条形码及其二级结构的菊科药用植物的系统发育分析＊

韩芳平，谢才友，兰 卓，任瑶瑶，谭 睿

（西南交通大学生命科学与工程学院 成都 610031）

菊科（Compositae）是比较年轻且进化程度较高的一个大科，在数量和分布范围上均居世界之冠，是被子植物中最大的科[1]，约 1000 多属，25000-30000 种，我国约200多属，2000余种[2]。菊科植物味甘苦、性寒,具有疏风、清热、解毒的功效,可用来治疗感冒引起的头痛发热，心胸烦闷。其提取物如倍半萜内酯具有抗肿瘤、抗疟和防治心血管疾病等方面的作用，其他提取物也多具消炎、抗凝、钙拮抗等生物活性[3]。

以往对于植物的鉴定与分类，多基于专业人员在形态学方面的观察，需要鉴定人员大量实践经验的积累，且制约着植物鉴别的精度与效率。2003 年加拿大生物学家Hebert 等[4]提出了DNA 条形码技术，利用来自标准基因组区域的短序列来识别物种，为生物分类提供了新的技术手段，成为了分类学的里程碑[5-6]。内部转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS2）是核基因[7]，包含由 5.8SrDNA 分隔的 ITS1 和 ITS2，其中ITS2 序列片段较短，容易与单对引物结合，易于测序与扩增，且种间变异度高，在物种和亚种水平上的识别信息最为丰富[8]。此外，ITS2 二级结构的分子形态特征甚至允许ITS2 区域在测序错误及假基因出现的情况下保持高准确度[9]，因此可靠性高，并作为物种新的可识别特征，为分类和精确识别奠定基础[10，11]。Gao等[12]的研究表明，在rbcL、matK、ITS1、ITS2、psbA-trnH这五种DNA 区域中，ITS2 在菊科植物的广泛性、序列变异和鉴定能力方面最有效，因此本实验采用ITS2 作为条形码进行鉴别。

药用植物有些经过加工炮制后外形特征丢失，与其近缘种外形及其相似，鉴定困难[13]。市场上流通的菊科药材也存在混伪、掺假现象。而菊科药用植物在《中国植物志》中有7 卷11 册之多，种类繁多更加不易区分。本实验拟使用ITS2 对于川藏地区的常见菊科药用植物进行鉴别。

本实验基于ITS2 作为条形码的手段，通过对西藏自治区、四川峨眉、乐山、康定等地区采集的菊科植物样本及Genbank 下载的序列进行遗传距离、NJ 系统进化树的分析以及ITS2 二级结构的比较，对菊科药用植物进行较为准确的分类，避免了菊科植物的混淆，同时也为菊科植物在资源和种源的利用和保护方面提供了理论依据。

1 材料

从四川省峨眉山、乐山、康定及西藏自治区采集了46份菊科植物标本，经西南交通大学生命科学与工程学院宋良科副教授鉴定，牛蒡子（Arctium. lappa）3份，天名精（Carpesium abrotanoides）2 份，贵州天名精（Carpesium abrotanoides）2 份 ，艾 纳 香（Blumea balsamifera）1 份，缘毛紫菀（Aster souliei）1 份，鬼针草（Biden.s pilosa）1份等，标本详情请见表1。

2 方法

2.1 样品DNA提取、PCR扩增及测序

取药材干重组织约30 mg,加入液氮充分碾磨，使用植物 DNA 提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取总DNA，提取步骤按照试剂盒说明。

以样品DNA作为模板，对ITS2进行PCR扩增：

正向引物ITS2F5'ATGCGATACTTGGTGTGAAT3';

反向引物ITS3R，5'GACGCTTCTCCAGACTACA AT3'。

PCR 反应条件:①94℃变性 5 min；②94℃变性30 s；③56℃退火30 s；④72℃延伸7 min；⑤重复上述步骤40 次；⑥72℃延伸10 min。将PCR 产物送至成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序[14]。

2.2 数据处理

基于隐马尔可夫模型（Hidden Markov Model，HMMer）注释ITS2 序列，从而获得标准的ITS2 间隔区序列。所有ITS2序列用MEGA7.0进行种内、种间K2P（Kimura 2-parameter）遗传距离的计算，并基于K2P 距离使用相邻结合法（Neighbor Joining，NJ）构建系统进化树[15]。利用靴带（Booststrap）法1000 重复检验各分支的支持率。在Koetschan[16]等建立的ITS2 数据库网站(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de)预测各样本ITS2序列二级结构。

3 结果

3.1 序列长度及种内、种间K2P遗传距离分析

用MEGA7.0 对所有样品序列及下载的序列进行比对，结果表明ITS2 序列长度在209-233 bp 之间，全序列排序比较长度为242 个位点,GC 含量在48.9%-64.1%范围内（表1）。

物种间、种内的遗传距离越小，同时物种间遗传距离越大，则其用DNA 条形码进行分类和鉴定的效果越理想[17，18]。应用 MEGA7.0基于 K2P 模型计算所有样品种内和种间遗传距离，种内遗传距离为0-0.009，种间遗传距离为0.031-0.727，其中种内最大遗传距离为0.009，种间最小遗传距离为0.031，种间遗传距离远大于种内遗传距离。

热图结果显示（图1），菊科样品种内，属内K2P 遗传距离小，在热图中颜色浅；各属之间遗传距离大，在图中为颜色较深的区域；其中紫菀属与其他属遗传变异值较大，在热图中所对应的区域颜色最深。

统计并分析样本种间和种内遗传距离的分布情况发现，不同样本间存在较大的barcoding gap，表明ITS2 序列对供试样本在种水平具有较强的鉴定能力。从图2中还可观察到种间变异距离值主要集中在0.1-0.6 之间，其中0.1-0.2 区间主要由艾纳香属和天名精属遗传距离组成，0.2-0.3 这一区间主要是石胡蒌属、牛蒡子属与蒿属之间的遗传距离组成，0.3-0.4区间主要由天名精属、鬼针草属、艾纳香属和蝟菊属的遗传距离组成，而0.4-0.6之一区间主要是紫菀属与其他各属的遗传距离，这一结论也与热图所得结果一致。

3.2 NJ树分析

用MEGA7.0 对ITS2 基因进行序列比对并构建NJ系统聚类树，利用靴带（bootstrap）检验法1000 次检验各分支支持率，结果见图3。由NJ 树可看出个样本聚为两大支，蒲公英属蒲公英与其他各属种分开为2支，单成1 支，另1 支包含17 属23 种。各属内各种聚为小支，聚类效果整齐准确，单系性好；并且可分别观察到鬼针草属与苍耳属，蝟菊属与牛蒡子，千里光属与蟹甲草属，火绒草属与鼠麴草属亲缘关系较近。分支之间靴带检验法支持率在50%以上，可见ITS2条形码在对样本18属24种可在种的水平上很好地区分。

表1 菊科植物样本信息

图1 菊科植物样本种间和种内距离

表2 GenBank下载菊科植物ITS2序列

图2 菊科植物样本ITS2 序列种内和种间变异分布

3.3 ITS2二级结构的分析

图3 基于ITS序列构建的菊科植物样本的NJ树

根据ITS2 数据库及其网站预测供试菊科药用植物ITS2 二级结构（图4）。所有二级结构均为1 个中心环（主环）及4 个螺旋区（helix）组成，每个螺旋区又具有数量不一、大小有别的茎环（loop）结构。由二级结构可以看出，黄花蒿、鬼针草、天名精、鼠麴草、羽裂绢毛苣、缘毛紫菀与蒲公英二级结构相似，但其在中心环的大小、形状以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ螺旋区的茎环数量、大小及位置均有差异，可以彼此区分。其中缘毛紫菀比其他几个相似的二级结构在Ⅰ、Ⅲ区茎环数多且形状更大，区别明显。艾纳香、贵州天名精、牛蒡子、石胡蒌、火煤草和苍耳二级结构的中心环相似，其中Ⅱ区结构也相对保守，但Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ区茎环数目、大小存在明显差异。

在进行对样本ITS2 二级结构的比较时，可以发现二级结构的相似性和种属关系无关，即使一个属的物种，如天名精与贵州天名精，其二级结构依旧差异显著。一些样本的种间二级结构相似，但在中心环及4个螺旋区仍存明显差异，可以将各供试样本直观鉴别出来。

4 讨论

菊科植物在我国品种繁多，资源丰富，含黄酮、萜类、生物碱等化学成分，具有清热解毒、散瘀止痛、祛风除湿等功效，在预防心血管疾病及抗肿瘤方面也有巨大的潜在价值[3,19]。屠呦呦等对菊科中药青蒿的化学成分进行了深入研究，分离了倍半萜内脂、黄酮醇、香豆素、青蒿酸，以及具有治疗支气管炎的有效药物青蒿挥发油，其中最重要的是具有抗疟功能的有效成分青蒿素[20]。艾蒿可止血安胎，是妇科常用中药[21]。紫菀可润肺下气，化痰止咳，而鬼针草、千里光等具有清热解毒，活血祛风的功效[22]。目前很多菊科植物资源仍处于零星采集的状态，未得到合理、充分的开发与利用[23]，因此对菊科植物建立快速准确的鉴定方法是十分必要的。

图4 菊科ITS2 序列的二级结构

ITS2作为一种通用的DNA 条形码，已被用于药用植物及其近缘种的鉴定[24，25]。此鉴定方法具有快捷、准确、对形态学分类技术要求不高的特点[26]。本研究对44 份样本进行DNA 提取、PCR、测序，并成功获得ITS2序列，结合GenBank 上下载的17条菊科药用植物ITS2 序列，基于ITS2 对菊科药用植物样本分析。使用MEGA7.0 软件对种内、种间K2P 种内遗传距离进行计算。计算结果为种内遗传距离0-0.009，种间遗传距离为0.031-0.727，种间遗传距离明显大于种内遗传距离，说明可以使用ITS2对供试样本进行分析鉴别。

基于K2P 遗传距离构建NJ 树可观察到18 个属聚成两大支，各属又各自成束，单系性良好，可以明显区分各属样本，同时能够观察到不同属亲缘关系的远近程度。利用ITS2 数据库分析各样本ITS2 序列二级结构，分析结果表明ITS2 序列可以对菊科药用植物进行准确的鉴定，尽管一些样本间二级结构相似，但仍具各自特征，可以直观、准确地进行区分。并且在某些样本质量少、DNA 提取效果不佳的情况下也可获得双向序列并成功分析，并不影响实验结果。

本研究结合了DNA 条形码技术对川藏地区部分菊科药用植物进行了鉴定，结果证明ITS2 可以稳定、准确地鉴定菊科植物，也为菊科植物的安全药用提供了基础。但是ITS2 对植物的分类鉴别需要在大量样本序列的基础上进行，因此在样本采集方面有一定难度和数量、质量上的要求，本研究仅采集了川藏地区部分菊科植物进行鉴定，对于数量众多的菊科药用植物的研究有待更多样本的采集和深入研究，将更有利于菊科药用植物的开发与利用。