麻黄连翘赤小豆汤对5-HT所致瘙痒模型大鼠与不同细胞系中5-HT1A及GRPR表达的影响＊

肖珍妮，金 路，谭张奎，陶春晖

（湖北中医药大学中医临床学院 武汉 430061）

瘙痒通常被定义为一种能引起极强烈搔抓欲望的不悦反射[1]。与对温、热、痛的感觉类似，瘙痒也是机体正常生理状态下的一种重要自我保护机制[2]。多项流行病学调查发现，13.5%的成人患有瘙痒症，人群中一年内出现强烈搔抓行为的比率是16.4%[3]。瘙痒不仅见于多种常见皮肤疾患，不少系统性疾病均有皮肤瘙痒的临床表现，严重影响患者的生活质量。目前抗组胺药是临床上治疗瘙痒症的首选药物，但其对大部分瘙痒症无明显效果，且副作用较大，这可能与抗组胺药只针对组胺独立引发的瘙痒有关。慢性瘙痒症患者非常容易陷入“瘙痒-搔抓-瘙痒”的恶性循环之中[4]，持续的瘙痒可能使患者出现皮肤破溃、感染等一系列表现，也可能导致患者焦躁，甚至表现出抑郁或自杀倾向[5]。有研究表明，脊髓背角（Spinal dorsal horn，SDH）神经节中表达的GRPR 可引起瘙痒，中枢性5-HT1a 受体与瘙痒的发生有关系[6，7]。另有研究证实，经5-HT1a 受体介导的胃泌素释放肽（Gastrin releasing peptide，GRP）/胃泌素释放肽受体信号通路是调控痒觉的重要信号通路之一[8]。麻黄连翘赤小豆汤最早见于《伤寒论》第262 条：“伤寒瘀热在里，身必黄，麻黄连轺赤小豆汤主之。”原方用于治疗阳黄兼表之证，以方测证，原文应有“身痒”的症状存在。全方组成为连轺（Radix Forsythia Suspensa）、生梓白皮（Cortex Catalpae）、赤小豆（Semen Phaseoli）、麻黄（Herba Ephedrae）、大 枣（Fructus Jujubae）、生 姜（Rhizoma Zingiberis Recens）、杏仁（Semen Armeniacae Amarum）、炙甘草（Radix Glycyrrhizae），连轺、生梓白皮现临床已多不用，由连翘（Fructus Forsythiae）、桑白皮（Cortex Mori）代替[9-10]。多年临床实践表明，此方针对常见瘙痒症状的病理病机，在皮肤病的治疗中针对属于湿热引起的瘙痒症状疗效确切，禁忌症不多，尚无明显严重副作用的报道[11]。因此，本实验以5-HT1a-GRPR 协同效应为切入点，建立5-HT诱导的大鼠瘙痒模型，旨在研究麻黄连翘赤小豆汤治疗瘙痒症的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠40 只，体质量（160 ± 20）g，购自湖北省实验动物研究中心。动物质量许可证号SCXK（鄂）2015-0018。大鼠采用标准饲养，动物房空调控温，温度（23± 2）℃，相对湿度60% ± 5%，日光灯控明12 h，明暗交替，大鼠自由摄食饮水。动物实验获得湖北中医药大学实验动物伦理委员会的批准（伦理审查证号：HUCMS201909007），本实验完全遵循国家实验动物福利伦理的相关规定，符合动物保护、动物福利和伦理原则。

1.2 中药制备

按照原书剂量1两等于3 g进行折算，麻黄连翘赤小豆汤所有药物饮片均购自湖北省中医院，鉴定人陶春晖。用传统煎药方法，药物浸泡0.5 h 后连续煎煮2次，低温浓缩成低、中、高3种浓度，灭菌，4℃冰箱内贮存备用。根据《中药药理研究方法学》[12]，临床等效剂量按人与大鼠体表面积比值计算得出，中药浓度分别为4300 mg·kg-1、8600 mg·kg-1、17200 mg·kg-1。

1.3 实验试剂

5-羟色胺盐酸盐（北京索莱宝科技有限公司，批号：419C021）；水合氯醛（国药集团，批号：10009218）；磷酸酶抑制剂（碧云天生物技术，批号：S1873）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术，批号：P0010）；兔多抗 5HT1A（武汉博士德，批号：bs-1124R）；兔多抗GRPR（affinity，批号：DF7114)；兔多抗GAPDH（杭州贤至生物，批号：AB-P-R001）；HRP 标记羊抗兔二抗（武汉博士德，批号：BA1054）；二甲苯（国药集团，批号：10023418）；苏木素（Sigma，批号：H9627）；盐酸（国药集团，批号：10011018）。

1.4 实验仪器

微量移液器（德国Eppendorf）；电泳仪电源（北京六一仪器厂）；垂直电泳槽（北京六一仪器厂）；电转仪（北京六一仪器厂）；水平摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；pH 计（德国Metter-Toledo GmbH 公司）；电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；磁力搅拌器（江苏金坛市中大仪器厂）；酶标仪（美国Thermo）；高速低温离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；qPCR（美国Applied Biosystems 7500）。

2 实验方法

2.1 动物分组、造模及给药

随机将40只雄性SD 大鼠分为空白组，模型组，麻黄连翘赤小豆汤低、中、高3 个剂量组，每组8 只。参照文献[13]，实验前3 天将大鼠颈背部毛发剪去，模型组及药物干预组大鼠于其颈背部皮内（肩脚连线中点上方 5 mm 处）注射 10 μ1 2%5-HT（94 mmol·L-1）溶液，空白组大鼠注射等量等体积生理盐水，进针10 s，注射完毕后留针约5 s以防药液外漏。造模完成后，分别以4300 mg·kg-1、8600 mg·kg-1、17200 mg·kg-1浓度的麻黄连翘赤小豆汤和等体积的生理盐水灌胃治疗14天。

2.2 动物标本采集及处理

药物干预14 天后，用10%水合氯醛按0.33 mL·kg-1腹腔注射麻醉大鼠。待大鼠麻醉成功后，剃毛器剔除腰部皮毛，酒精棉球擦拭手术区，将其俯卧位固定于解剖板上，分离脊柱两旁肌肉充分暴露，取出C3-C5段脊髓，将其置于冻存管中，放置-80℃冻存备用。

2.3 细胞培养

表达GRPR的人前列腺癌PC-3细胞与表达HTA1的 HKE-293 细胞购自 ATCC，PC-3 细胞于 RPMI-1640培养基中培养，培养基中添加10%胎牛血清、PEST（青霉素 100μg·mL-1、链霉素 100μg·mL-1）和 2μmM L-谷氨酰胺。HKE-293 细胞则在含有10%胎牛血清的高糖HyClone 培养基中培养。培养箱环境稳定在37℃和100%相对湿度，5%二氧化碳+95%空气。胰蛋白酶EDTA（0.05%胰蛋白酶，0.02%EDTA 缓冲液；生物色素AG）用于细胞分离。在倒置显微镜下观察细胞生长状况。当细胞密度达到90%以上时，接种于24孔板（每孔2×105个细胞）。

2.4 指标测定

2.4.1 行为学观察

分别选取空白组和模型组中注射过程无明显激惹的大鼠各3 只，放入与饲养环境基本相同的透明观察笼内，在观察笼的上方放置高清摄像机，同时记录两组大鼠的搔抓行为，记录期间，保持室内安静，实验人员离开观察室，1小时后关闭摄像机，结束拍摄。行为学观察以大鼠的搔抓次数作为评判标准：以大鼠后爪触碰搔抓身体任何区域的皮肤，到其爪离开或舔舐作为一个完整的搔抓动作，在此期间不管搔抓多久，均记为1次。

2.4.2 免疫蛋白印迹法测定SDH 中5-HT1a 和GRPR蛋白表达

用RIPA 裂解液提取脊髓中的蛋白，蛋白质含量测定采用BCA 法，随后作SDS-PAGE 转膜封闭，滴加抗5-HT1a，GRPR 一抗（1∶1000）孵育，滴加HRP 标记二抗（1∶50000）并孵育2 h。最后按说明流程显现荧光带，最终显影液显影、定影液定影，晾干，扫描，采用Band Scan 软件分析获取各组大鼠的蛋白条带表达灰度值。

2.4.3 免疫组化法测定SDH 中5-HT1a 和GRPR 蛋白表达

用4%多聚甲醛固定脊髓，取石蜡切片脱蜡、脱水后浸泡到配制好的枸橼酸缓冲液盒中进行微波修复；采用3%H2O2在室温孵育15 min；用5%山羊血清封闭30 min；滴加 50μL 的 5-HT1a、GRPR 抗体（一抗稀释浓度均为1：100），同时用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗设立阴性对照，将切片放入湿盒中，4℃过夜；滴加山羊抗兔二抗（1∶1000），室温下放置30 min；滴加ABC工作液，37℃孵育20 min；DAB显色；苏木素复染；二甲苯透明封固。染色一脊髓基质表层和中层出现棕黄色颗粒为染色阳性。使用IPP6.0 软件对免疫组化照片进行光密度分析。

2.4.4 实时荧光定量PCR 技术测定细胞中5-HT1a 和GRPR mRNA表达量

将传代后PC-3 细胞与HKE-293 细胞分别分为，空白组、对照组与干预组，所有分组分3 个复孔进行。空白组不做处理，对照组加入20μL 培养基，加药组加入 20μL 过滤后药物（8.6 mg·mL-1），经24 h 后终止培养。随后在细胞培养孔中加入800μL Trizol，随后依次加入细胞裂解液氯仿、异丙醇与75%酒精提取总RNA。将RNA溶于加入DEPC（焦碳酸二乙酯）的去离子水随后用紫外分光光度计测定A260及A280定量分析RNA 的纯度和浓度。进而根据总RNA 浓度和反转录试剂盒逆转录成cDNA，反应条件为：退火25℃，5 min；延伸42℃，60 min；失活70℃，5 min。检测引物（表1）为。

表1 研究中所用荧光定量PCR引物

qPCR 反应体系包括 10 μL 的 SYBR Green Premix Ex Taq II，正反向引物 1.6μL（5 pmol·μL-1），4.8μL 的ddH2O 与 2μL 的 cDNA。反应条件为预变性 95℃，30 s，变性95℃，5 s，60℃，30 s，循环数40；溶解曲线：95℃，15 s，60℃，30 s，95℃，15 s。检测以GAPDH 为内参，校正每个样品的Ct值，得ΔCt值。

2.5 统计学分析

采用SPSS25.0 统计软件处理，数据测定值以均数±标准差（）表示，符合正态分布和方差齐性时用单因素方差分析，两组样本均数间比较采用独立样本t检验，P＜0.05时认为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 对瘙痒模型大鼠痒觉的影响

与空白组比较，模型组在第1、7、14天搔抓次数显著升高（P＜ 0.01）；与模型组比较，低、中、高剂量组在第1 天差异无统计学意义，在第7、14 天搔抓次数显著降低（P＜ 0.01）；高剂量组较低中剂量组更显著（P＜0.05）（表2）。

3.2 麻黄连翘赤小豆汤对瘙痒模型大鼠SDH 中5-HT1a和GRPR表达的影响

3.2.1 免疫组化检测结果

染色以棕黄色颗粒为阳性染色，空白组大鼠脊髓背角神经节胞浆5-HT1a和GRPR呈弱阳性表达，模型组大鼠脊髓背角神经节胞浆5-HT1a 和GRPR 呈阳性表达。麻黄连翘赤小豆汤低、中、高剂量组大鼠脊髓背角神经节胞浆5-HT1a和GRPR呈弱阳性表达。

表2 各组大鼠有效搔抓次数差异性比较（，n = 8）

表2 各组大鼠有效搔抓次数差异性比较（，n = 8）

注：与空白组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；与模型组比较，##P ＜ 0.01；与中剂量、低剂量组比较，△P ＜ 0.05

高剂量治疗组71.67±4.51 52.00±3.00##△37.33±3.06##△组别/天数第1天第7天第14天空白组17.67±7.51 18.00±2.00 17.33±3.51模型组79.67±4.73**76.00±2.00**74.67±2.52**低剂量治疗组71.00±3.00 67.67±1.15##65.33±2.30##中剂量治疗组71.33±4.04 63.67±1.53##60.33±2.52##

表3 各组大鼠5-HT1a和GRPR蛋白免疫组织化学染色阳性表达平均光密度值的比较（，n = 3）

表3 各组大鼠5-HT1a和GRPR蛋白免疫组织化学染色阳性表达平均光密度值的比较（，n = 3）

注：与空白组比较**)P ＜0.01；与模型组比较##)P ＜0.01

--GRPR 0.01±0.01 0.10±0.02**)0.08±0.01**, ##)0.08±0.01**, ##)0.05±0.01**, ##)组别空白对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组剂量/(mg·kg-1)4300 8600 17200 5-HT1a 0.04±0.02 0.17±0.01**）0.09±0.11**, ##）0.09±0.08**,##）0.09±0.04##）

表4 各组大鼠5-HT1a和GRPR蛋白表达的比较（，n=3）

表4 各组大鼠5-HT1a和GRPR蛋白表达的比较（，n=3）

注：与空白组比较*)P ＜ 0.05，**)P ＜ 0.01；与模型组比较#)P ＜ 0.05，##)P ＜ 0.01

GRPR/GAPDH 0.24±0.01 0.57±0.05**)0.50±0.03**)0.40±0.01**, ##)0.35±0.04*, ##)组别空白对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组剂量/(mg·kg-1)--4300 8600 17200 5-HT1a/GAPDH 0.24±0.04 0.59±0.06**)0.52±0.06**)0.42±0.05**, #)0.36±0.04##)

图1 各组大鼠SDH中5-HT1a的表达变化（免疫组化，400×）

与空白组比较，模型组大鼠SDH中5-HT1a、GRPR的平均光密度值显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各治疗组5-HT1a、GRPR 平均光密度值显著减少（P＜0.01）（表3、图1、图2）。

3.2.2 免疫印迹检测结果

与空白组比较，模型组大鼠SDH 中5-HT1a、GRPR 蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，黄连翘赤小豆汤中、高剂量组5-HT1a、GRPR 蛋白表达显著下降（P＜ 0.05，P＜ 0.01），而低剂量组SDH 中5-HT1a、GRPR蛋白表达无明显差异（表4、图3）。

3.3 对细胞中5-HT1a和GRPR表达的影响

结果显示，在PC-3 细胞中，空白组与对照组GRPR mRNA 表达量无显著性差异；然而，与对照组比较，麻黄连翘赤小豆汤处理组GRPR mRNA 表达量下降，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）；在HKE-293细胞中，空白组与对照组5-HT1a mRNA 表达量同样无显著性差异；与对照组比较，麻黄连翘赤小豆汤处理组5-HT1a mRNA 表达却下降，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4、图5）。

图2 各组大鼠SDH中GRPR的表达变化（免疫组化，400×）

图3 免疫印迹法检测DRG中5-HT1a、GRPR蛋白表达

图4 各组PC-3细胞中GRPR mRNA表达的比较

4 讨论

图5 各组HKE-293细胞中5-HT1a mRNA表达的比较

瘙痒症通常被纳于中医学“风瘙痒”“痒风”等范畴，传统中医学认为，瘙痒常由内外二因所致，脏腑气血失和为其内因，风、湿、热、毒、虫等为其外因，而湿热乃是瘙痒的重要病机。麻黄连翘赤小豆汤初出自于东汉张仲景所著《伤寒杂病论》一书，方中取麻黄、杏仁、生姜宣散肺气、解表散寒之效，共祛表邪，以连翘、赤小豆、桑白皮等祛湿除热为臣药，辅以甘草、大枣以调和药性，再与生姜相伍，健脾和中，调其营卫。诸药合用，使麻黄连翘赤小豆汤具有解表散邪、祛风止痒、清热除湿之效。因此，临床上可用其治疗湿热型皮肤瘙痒相关疾病。关于麻黄连翘赤小豆汤止痒的作用机理，在此之前已有一些研究，麻黄连翘赤小豆汤能够对外源性组胺和右旋糖酐诱导释放内源性组胺动物瘙痒模型起到明显止痒作用，同时通过对方中麻黄的实验研究表明麻黄碱对豚鼠局部疹痒及小鼠全身痛痒也有显著的止痒作用[14]。本课题组前期研究发现麻黄连翘赤小豆汤能抑制肥大细胞脱颗粒，减少组胺释放，从而保护肥大细胞，对抗Ⅰ型变态反应，直接或间接的止痒[15]，但是，因缺少明确痒觉产生-传递-效应通路研究对照，缺少对麻黄连翘赤小豆汤止痒机理的充分研究。本实验以5-HT1a-GRPR 协同效应为切入点，发现麻黄连翘赤小豆汤对5-HT 诱导的瘙痒模型大鼠治疗效果显著。

5-HT 又被称为血清素，广泛存在于人类外周组织和血小板中，少数存在于其他动物的肥大细胞中，是中枢神经系统中重要的神经递质之一[16]。5-HT 作为单胺类神经递质，被认为在痛觉传导中有着关键而复杂的作用，最近有研究证实，它在瘙痒的传导中也起到了关键作用。高剂量的5-HT 可以引起人或鼠类的疼痛和瘙痒感，而低剂量的5-HT 只能引起瘙痒[17]。另有研究显示，大鼠腰脊髓背角浅层神经元对注射5-HT 有反应，5-HT 反应神经元也对多种醛原子有反应[18，19]。有研究表明，对SD 大鼠注射经典的致痒介质组胺，大鼠会出现类似疼痛的表现20]，但对SD 大鼠皮内注射5-HT 后则出现后爪搔抓的行为1]。因此，许多课题组以5-HT 作为致痒剂，建立SD 大鼠瘙痒模型来研究瘙痒的调节机制[17-19]。本研究采用SD 大鼠一次性颈背部皮内注射5-HT 溶液制作瘙痒模型，造模完成约0.5 h 左右，大鼠开始出现明显的搔抓行为，与空白组比较搔抓次数显著增多，提示瘙痒模型大鼠复制成功。

目前已确认的5-HT 受体有14 个，每个受体又有很多不同的亚型，有几种分布在脊髓背根神经节中。5-HT 被认为是诱发疼痛或瘙痒的强力因子[22，23]，在生理或病理状态下，自延髓头端腹内侧区的中缝大核分出的5-HT 下行通路，可能抑制或促进脊髓背角疼痛或瘙痒信号的传递[18]。伴随各种5-HT 受体亚型的大量发现，对疼痛或瘙痒信号的处理产生更加复杂的影响。5-HT1a 受体是由一种G 蛋白偶练联受体，由421个氨基酸及1309个碱基对组成。它与G 蛋白偶联，抑制腺苷酸环化酶（Adenylate Cyclase，AC）的活性，抑或激活磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）进而使磷酸肌醇活化的方式参与细胞功能。5-HT1a 受体主要分布区为中缝核、海马、脑叶、脊髓背角等部位，可分为突触前膜和突触后膜两种受体，处于突触前膜的5-HT1a受体又被称作5-HT1a 自身受体，可调控5-HT 的释放[23，24]。近来，越来越多研究表明 5-HT1a 受体在 5-HT 神经元调控的中枢神经系统中起到了重要作用，与抑郁、认知功能障碍、精神分裂症、自然生物钟紊乱也有一定的关系[17,23]。在临床试验研究中发现，使用5-HT3 受体拮抗剂[25，26]或者选择性 5-HT 再吸收抑制剂[27，28]可缓解胆汁淤积性瘙痒。本研究发现瘙痒模型大鼠SDH 中的5-HT1a 受体表达增加，而麻黄连翘赤小豆汤给药后，能够抑制瘙痒模型大鼠SDH 中5-HT1a受体的表达。

GRP 是另一个涉及瘙痒脊髓传输的神经肽[18，19,23,29]，是由 27 个氨基酸组成的多肽，在哺乳动物的中枢神经系统和胃肠道中存在较多[29]。它和蛙皮素是同系物，与其特定的G 蛋白偶联受体结合形成的GRPR，也称作蛙皮素2 型受体，其在各种生理功能中发挥重要作用。GRPR 在脊髓背角浅层的神经元中表达[30]，当脊髓中表达GRPR 的神经元被切除后，小鼠不能引起任何搔抓行为[31]。研究表明，皮内注射GRP 后激活大鼠一部分脊髓背角神经元，引发大鼠的搔抓行为[32，33]。另有研究表明，通过髓鞘内注射神经毒素，破坏大鼠脊髓背角神经元中GRPR 的表达，可以显著降低组胺和非组胺诱发的瘙痒感，但不影响疼痛的感觉传导[32-34]。由此可见，GPR/GRPR 是瘙痒在脊髓中传到的特异性信号通路。后续研究发现，特异性皮炎患者体内外周血清GRP 表达水平和皮肤瘙痒程度呈正相关[35]，皮内注射GRP 可以激活肥大细胞诱导大鼠的搔抓行为[36]。说明GRP 不仅在脊髓瘙痒信号传导中有作用，在外周瘙痒信号传导中也发挥一定作用。本研究同样发现在瘙痒模型大鼠的脊髓背角中GRPR表达增加，而经麻黄连翘赤小豆汤治疗后的大鼠脊髓背角中GRPR的表达明显降低。

综上所述，5-HT 是引起瘙痒的介质之一，麻黄连翘赤小豆汤可能是通过调控5-HT1a 受体的表达，抑制其与GRPR 的协同效应从而实现治疗瘙痒症的效果。另外，本课题前期研究表明，麻黄连翘赤小豆汤是通过对肥大细胞脱颗粒的抑制作用，改善变态反应性炎症，后续研究发现，麻黄连翘赤小豆汤可以经由PAR2-TRPV1 通路干预Ⅰ型变态反应环节，减轻甚至缓解胆汁淤积性瘙痒。然而，瘙痒症发病机制较复杂，麻黄连翘赤小豆汤是否还能通过其他途径发挥作用，还有待深入研究。