一株高效苯酚降解菌的性能研究及动力学分析

黄慧 李文兵 张政 邓萌 王光华

(武汉科技大学化学与化工学院 绿色与智能煤化工工程技术研究中心 武汉 430081)

0 引言

由于苯酚的毒性，有效去除工业废水中的酚类化合物，对环境保护具有重要的现实意义。如果这类物质处理不当，会造成对土壤和地下水的污染，且其毒性会严重影响生物的生存。一旦含酚类化合物的废水排放到水体中，即使5～25 mg/L的低浓度也会危及鱼类的生命[1]。经过物理和化学处理后，苯酚质量浓度能降至0.3～0.4 g/L。除了物理方法和化学方法外，生物处理法在废水处理中起着至关重要的作用。近年来生物技术因其危害少，无二次污染且成本低被广泛应用,被认为是一种安全、环保和廉价的碳氢化合物污水处理技术[2]。

从武汉石化污水处理厂的活性污泥中分离出一株产生物表面活性剂、降解苯酚的双效菌BPH-3。本文主要研究其生理生化特性，苯酚降解性能,及其降解苯酚的动力学分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌源

以武汉石化污水处理厂生化池的活性污泥为菌源。

1.1.2 培养基

富集培养基(g/L)：蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、NaCl,溶液pH值调至7±0.2，121 ℃高温高压灭菌20 min。固体培养基加入10～20 g/L琼脂。

无机盐培养基(g/L)：(NH4)2SO41 g、KH2PO41g、K2HPO41 g、NaCl、MgSO4·2H20 0.2 g、FeSO4·7H2O 0.02 g、无水CaCl20.02 g。

1.2 方法

取10 mL泥水混合物于石蜡浓度为1%的无机盐培养基中，置于150 r/min、30 ℃摇床中恒温震荡，待溶液变浑浊后，转接至新以石蜡为碳源的无机盐培养基中。采用稀释平板分离法筛选出能产生物表面活性剂的菌株，再以苯酚为唯一碳源,筛选出既产生物表面活性剂又降解苯酚的双效菌。

1.2.1 菌株鉴定

对菌株进行细胞和生理生化鉴定。生理生化鉴定实验包括糖类利用、淀粉水解、过氧化氢酶、革兰氏染色实验等[3]。

研究采用16S rDNA基因序列分析法对菌株进行了鉴定。

1.2.2菌株生长曲线及不同影响因素对苯酚降解的影响

以苯酚为底物，对菌株的生长进行了研究。用浊度法间接测定菌体的生长速度，于30 ℃，摇床转速为150 r/min培养24 h；以不接种的无机盐培养基溶液作为对照，用紫外分光光度计检测培养基菌液浓度(OD600)。

采用4-氨基安替比林法测定溶液中苯酚浓度。

1.2.3 不同苯酚浓度对菌株降解速率的影响

测定不同浓度的苯酚对菌株生长速率的影响及苯酚降解速率的研究。在无机盐培养基中添加不同浓度的苯酚(200、400、500、600、700、800、900、1 000、1 100 mg/L) 在30 ℃、摇床转速为150 r/min培养12 h后，测定培养基中苯酚浓度。

苯酚降解动力学分析：以苯酚为唯一碳源的生物学降解中，苯酚既是反应基质，也是有毒物质。因此采用Haldane方程对菌株BPH-3的降解动力学进行分析[4]。

1.2.4 不同pH值对菌株降解性能的影响

在无机盐培养基中加入700 mg/L的苯酚，将培养基pH值分别调至3、4、5、6、7、8、9、10、11，在温度为30 ℃、摇床转速为150 r/min条件下培养12 h后，测定培养基中苯酚浓度。

1.2.5 不同温度对菌株苯酚降解性能的影响

测定不同温度条件下，菌株的降解性能。无机盐培养基中加入700 mg/L的苯酚，pH值为7、摇床转速为150 r/min，温度分别为10、20、30、40、50 ℃条件下培养12 h后测定培养基中苯酚浓度。

1.2.6测定不同摇床转速对菌株降解性能的影响

在无机盐培养基中加入700 mg/L的苯酚，pH值为7，温度为30 ℃，摇床转速分别为50、100、150、200、250、200、350 r/min条件下培养12 h后，测定培养基中的苯酚浓度。

1.2.7 不同盐度对菌株降解性能的影响

测定不同盐度对苯酚降解性能的影响。在无机盐培养基中加入700 mg/L的苯酚，pH值为7，温度为30 ℃，通过添加NaCl调节培养基的盐度，盐度(NaCl质量百分比)分别为0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，培养12 h后测定培养基中的苯酚浓度。

2 结果与讨论

2.1 菌株的鉴定

2.1.1 菌株的形态

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菌株落在LB固体培养基呈乳白色、圆形、不透明，落边缘整、表面凸起，光滑湿润菌齐、且不易被挑起；菌株BPH-3扫描电镜图如图1所示，菌株BPH-3呈短杆状。

图1 菌株BPH-3电镜图

通过PCR技术对菌株PBH-3进行了16S rDNA测序。再使用NBCI基因库中blast对比分析，菌株BPH-3与数据库中的pseudomonas plecoglossicida stain的同源性达99%以上，结合菌株同源性，使用Mega X邻接法构建了菌株的系统发育树(如图2 所示)。最后结合菌株生理生化鉴定，初步判定菌株BPH-3属假胞杆菌。

图2 16S rDNA序列系统发育图

2.1.2生理生化鉴定结果(见表1)

表1 菌株生理生化特征

2.2菌株生长曲线及不同影响因素对苯酚降解的影响

2.2.1 菌株的生长曲线

经过多次分离纯化，得到了一株产生物表面活性剂的高效苯酚降解菌，并对其进行了进一步的研究。如图3所示，苯酚降解曲线趋势与OD600基本一致。前4 h，苯酚降解速度相对较慢，菌株生长较慢,说明菌株处于停滞期。随后的9h内，苯酚降解浓度急剧降低，12 h内，苯酚降解达到99%以上，细菌OD600表明，该菌株在此期间生长迅速。15 h后，菌株生长缓慢，这是由于培养基中苯酚被降解而缺乏所致。在以往的研究中，随着碳源的消耗，也可观察到菌株生长受到抑制。15 h后，菌液浓度开始下降。在整个过程中，菌液OD600的变化与培养基中苯酚浓度变化一致，表明菌株利用苯酚进行代谢和繁殖。

图3 菌株BPH-3生长及降解曲线

2.2.2 不同苯酚初始浓度对菌株降解速率的影响

处理含酚废水时，初始浓度是影响菌株降解性能的关键因素。菌株在不同苯酚浓度的生物降解情况如图4所示，当苯酚初始质量浓度为200 mg/L时，该菌株只需6 h完全降解；初始质量浓度为≤600 mg/L时菌株可在12 h内完全降解。初始质量浓度为900 mg/L时，菌株可在24 h内降解完。但苯酚初始质量浓度高于1 000 mg/L时，苯酚去除率明显降低。24 h内苯酚去除率只有36.34%，表明高浓度的苯酚对该菌株的代谢作用有抑制作用,随着苯酚浓度的升高，降解速率降低[5]。

图4 不同初始浓度对菌株BPH-3降解性能的影响

在不同苯酚初始浓度下，对苯酚初始浓度C与菌株比降解速率v作图，用origin按照Haldane方程进行拟合。结果如图5所示，当苯酚初始质量浓度低于600 mg/L时，菌株比降解速率随着苯酚浓度升高而升高；当苯酚初始质量浓度高于600 mg/L时，菌株比降解速率随着苯酚浓度升高而降低。该曲线符合Haldane模型，该动力学方程参数分别为：vm=0.791 1 h-1；Ks=130.327 9 mg/L；Ksl=1 546.054 mg/L；拟合相关系数R2=0.973。苯酚降解动力学方程为：

图5 菌株BPH-3降解动力学

2.2.3 不同初始pH值对菌株降解性能的影响

研究了菌株的苯酚降解性能随pH值的变化，在生物降解中，酶起着至关重要的作用，而pH值对酶的活性有显著影响。如图6所示，pH值在4～10间时，菌株均能生长降解苯酚，最佳pH值为7。pH值为6～8时，菌株的降解性能较好，15 h内，其降解率均达到99%以上。其中pH值为7时，苯酚降解率最高。pH=4时，苯酚降解效率急剧下降，其降解率为7.59%；pH=9和pH=10时，其降解率为71.93%和49.78%。结果表明，该菌株在中性和微碱性环境中均有良好的降解性能。

图6 pH值对菌株BPH-3降解性能的影响

2.2.4 不同温度对菌株降解性能的影响

研究了菌株BPH-3在温度变化下对苯酚降解性能的影响。酶在生物降解中起着重要作用，而温度是影响酶活性的重要因素之一[6]。如图7所示，菌株降解苯酚的最佳温度是30 ℃，12 h内菌株可将初始质量浓度为600 mg/L的苯酚完全降解，降解可达为100%。在15～30 ℃间，苯酚降解率随着温度的升高而升高。当温度高于30 ℃时，苯酚降解率会随着温度的升高而降低。温度为40 ℃时，苯酚的降解率最低。说明温度过高或过低都会使菌株的降解性能变差。

图7 温度对菌株BPH-3降解性能的影响

2.2.5 不同摇床转速对菌株降解性能的影响

氧是需氧菌代谢所需的重要条件之一，在一定范围内，培养基中的溶解氧量随摇床转速的增加而增加。摇床转速对菌株BPH-3的影响情况如图8所示，由图可知当摇床转速小于150 r/min时，在苯酚初始质量浓度600 mg/L时，12 h内的降解率随摇床转速的升高而升高。当摇床转速≥150 r/min时，苯酚降解率基本不变，均达99%上。

2.2.6 不同盐度对菌株降解性能的影响

盐度是影响菌株降解性能的重要因素之一，因此对该菌株的耐盐性进行了研究。实验结果如图9所示。当盐度小于3%时，菌株可在12 h内将初始质量浓度为600 mg/L的苯酚完全降解，当浓度大于3%时，12 h内菌株的降解性能急剧下降，盐度为3.5%，12 h内的降解率仅有25.78%。盐度大于4%时，12 h内菌株降解率基本为0。结果表明，高盐度条件下对该菌株的生长和苯酚降解有很强的抑制作用。

图8 摇床转速对菌株BPH-3降解性能的影响

图9 盐度对菌株BPH-3降解性能的影响

3 结论

(1)从武汉石化污泥中分离出一株产表面活性剂的苯酚降解菌BPH-3，经形态观察、生理生化鉴定、16S rDNA序列分析，该菌株为假单胞菌。

(2)菌株BPH-3降解苯酚的最优培养条件为pH=7、摇床转速为150 r/min、温度为30 ℃、盐度小于4%、苯酚质量浓度为600 mg/L时，12 h内的降解率可达100%。

(3)苯酚质量浓度为0～600 mg/L时，菌株生长情况较好，12 h内的苯酚降解率为100%，当苯酚浓度为600～800 mg/L时，苯酚对其有抑制作用，降解效率下降。12 h内降解率为60%，24 h内降解率为100%,菌株BPH-3的降解速率高于目前所研究的大多数菌株。

(4)菌株BPH-3的降解动力学符合Haldane模型，该动力学方程参数分别为：vm=0.791 1h-1；Ks=130.327 9 mg/L；Ksl=1 546.054 mg/L。