利用DHI奶样检测孕酮的可行性分析

邹杨，娄文琦，刘林

（1.北京奶牛中心，北京 100192；2.中国农业大学动物科技学院，北京 100193）

孕酮，又名黄体酮、黄体素，是奶牛发情周期中由黄体产生的一种类固醇激素，在血液、乳汁和唾液中均能检测到。孕酮的检测对于牧场区分奶牛妊娠状态、缩短产犊间隔、减少输精次数有着非常重要的意义，能够帮助牧场减少经济损失、节本增效。本文就孕酮的检测方法及中红外光谱检测原理对利用DHI奶样检测孕酮进行了可行性分析，以期为牧场利用孕酮检测数据指导生产提供理论依据。

1 孕酮检测的意义

随着我国国民经济的发展、人们生活水平的提高和城市化进程的加快，肉、蛋、奶的消费量大幅度增加。与此同时，对奶牛养殖业来说，养殖场对于养殖成本的要求更高，对精细化高效养殖技术的提升需求愈加迫切。

通过调查研究发现，奶牛产后能量负平衡、繁殖障碍和营养代谢病所带来的牧场奶牛淘汰率高达30%。Fetrow等[1]对美国62.5万头淘汰奶牛的调研数据表明，产后20d内的淘汰率占总淘汰率的11%，产后20～40d的淘汰率占8%，明显高于泌乳100d以后3%～4%的淘汰率。泌乳初期和泌乳高峰期的高淘汰率会给奶牛场带来巨大的经济损失，而高淘汰率背后所隐藏的牧场繁殖问题主要是发情鉴定不准确、生殖系统功能异常和受孕率低[2]。

图1 怀孕率对牧场效益的影响

威斯康辛大学麦迪逊分校比较了提高怀孕率对牧场效益的影响（图1），图中横坐标是牧场当前怀孕率，纵坐标是牧场希望怀孕率能达到的指标。假设牧场当前怀孕率是15%，如果提高到期望的22%，每头牛每年可以为牧场增加137美元的效益。

因此，快速有效地监测奶牛发情状态、减少空怀天数、提高受孕率，是改善牧场养殖效益水平的重要手段。同时，牛奶作为牧场最容易获得的奶牛个体样本，通过以奶样为基础，对反映奶牛产后繁殖系统恢复、早期妊检、妊娠状态的重要指标进行检测与监测，能够提升牧场繁殖精准管理水平、间接为牛群繁殖性能改良提供数据支持。

2 孕酮与奶牛繁殖

奶牛在排卵后几天（成熟卵子从卵泡排出进入子宫）就在卵巢上形成黄体，而孕酮是由黄体产生的，这种激素释放到血液中，同时也扩散到牛奶中。奶牛在发情期由黄体分泌的孕酮水平是周期性变化的，在发情后2～3d内黄体开始增大，孕酮分泌增加，血液和奶中孕酮含量迅速升高直至发情周期的第10天，然后出现坪值，在下一个发情周期（大约在第21天）的第3～4天孕酮水平下降。一旦牛只妊娠，母牛在卵巢上形成的黄体将不断产生孕酮。若没有妊娠，则子宫产生前列腺素将黄体溶解，随后孕酮的产生立即中止，新一轮的发情周期又将重新开始[2,3]。

图2 母牛产后乳汁孕酮含量变化曲线图[4]

图3 正常奶牛产后乳中孕酮含量的变化[5]

从母牛产后孕酮含量变化曲线图可以看出（图2），奶牛产后15～20d孕酮含量出现第一低谷期，即产后首次安静发情和排卵；产后30～35d为第一峰值期，即产后卵巢上新黄体发育期和子宫复旧基本完成期；产后40～45d为第二低谷期，即大多数母牛出现产后第一次发情期。所以牛在产后约1个月恢复卵巢周期性活动，约50d时第一次配种成功，配种后孕酮激素水平上升（图3）。有研究表明，产后到首次黄体活动间隔的遗传力为0.16[6]。

因此，通过个体孕酮水平的检测可以用于确定排卵、孕激素治疗监测和早期妊娠状态的评价；可以区分出已孕奶牛、休情期奶牛或发情周期不规律的奶牛；可以反映产后奶牛的繁殖系统恢复情况；可以采集用作间接反映奶牛性状的育种指标，用于群体改良。

3 孕酮的检测方法

应用放射免疫技术检测血液中孕酮浓度已开展多年，但是该方法费用昂贵，且需要特殊设备和训练有素的人员，试验期需3～7d。研究表明，奶中孕酮浓度是与血液中孕酮浓度相平行的[2]，证明牛奶中孕酮含量可以用来监测牛只的繁殖状态。

奶牛乳汁中孕酮常用检测方法有放射免疫测定法（RIA）、酶联免疫测定法、孕酮-ARIS 检测系统以及免疫胶体金技术[3]。这几种方法都是在免疫学基础上进行的，且各有其优缺点。

①放射免疫测定法具有灵敏度高、特异性强、应用范围广、操作方法简便、测定准确率高的优点，但是由于标记物具有放射性，且标记设备条件和技术要求较高，使其普及受到限制。

②酶联免疫测定法具有易学、迅速、成本低、无污染、无需昂贵仪器设备和专门技术的优点，但同时存在检测试剂盒操作程序复杂、测试时间长、需要专门的仪器设备和操作人员等缺点。

③孕酮-ARIS检测系统检测全乳孕酮含量的准确性较放射免疫法较差，且奶样中存在不利于ARIS测定的干扰因素。

④免疫胶体金技术是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。目前医学检验中应用的免疫胶体金快速诊断技术有两种，即胶体金快速免疫层析法和快速斑点免疫金渗滤法。

4 中红外检测

与传统的化学分析方法相比，中红外光谱分析方法对样品处理的要求不高、无需化学试剂，且能够快速无损地检测样品中各成分的含量。目前中红外光谱分析不仅能准确测定牛奶中乳成分（包括乳脂率、乳蛋白率、乳糖率）、体细胞数，同时还能够预测乳中脂肪酸、蛋白组分，以及牛奶的凝集性能[7]，并可用于酮病的检测及相应性状遗传参数估计[8～11]，而且通过使用中红外光谱技术对牛奶中特定物质建立预测模型，能够快速准确地分析和鉴定奶牛的饲料转化率、能量利用效率和甲烷排放等营养状况、判定奶牛的健康和生殖生理状况[12]。

5 中红外法检测牛奶中孕酮含量的可行性

中红外光区是波长在2500～25000nm（波数为4000～400cm-1）的电磁波，是绝大多数有机物和无机离子的基频吸收带，也是红外光谱中最适合进行红外光谱定性和定量的分析区域[12]。

化合物不同的官能团在光谱上呈现不同谱带数目、位置、性状和强度，从而可以定性分析有机化合物的种类，同时也可以根据物质组分的吸收峰强度，结合朗伯-比耳定律对化合物进行定量分析[13～15]。

孕酮是4-孕甾烯-3,20-二酮（图4），纯固样为白色或几乎白色的结晶性粉末，属于甾酮类化合物，分子含有两个处于不同化学环境的极性基团C=O。

图4 孕酮的化学结构式

图5 孕酮的红外光谱[16]

孕酮在1850～1500cm-1范围有三个吸收峰，位置分别在1662（v1）、1698（v2）、1617（v3）cm-1，其中处于较低频率的v1归属为C=O伸缩振动峰，处于较高频率的v2应归属于C20位C=O伸缩振动峰，中等强度的v3为C=C键伸缩振动峰[16]。孕酮的三个吸收峰均在4000～400cm-1的中红外光谱范围内，因此用中红外光谱法进行孕酮检测具有理论可行性。

6 小结

孕酮的检测对于牧场生产具有极大的作用，不仅可以检测牛只妊娠状态，还能够帮助牧场进行繁殖监控。而中红外光谱法在牧场最广泛的应用就是奶牛生产性能测定，检测奶样乳成分的同时在光谱分析中加入孕酮的检测，可以最大限度地利用DHI奶样，获得最大化回报，帮助牧场提质增效。