微波辐射预处理提取花叶滇苦菜总黄酮工艺及其乙酸乙酯萃取物的抑菌活性研究

陈 睿,钟茂程,杨燕红,陈旭波

(丽水学院生态学院,浙江丽水 323000)

花叶滇苦菜(Sonchusasper(L.)Hill)隶属于菊科苦苣菜属一年生草本植物[1]。原产欧洲和地中海,在中国列为一般入侵植物[2]。花叶滇苦菜具有清热解毒、消肿排脓、凉血化痪、消食和胃、清肺止咳、益肝利尿的功效,临床用于治疗急性痢疾、肠炎、痔疮肿痛等症[3-4]。

黄酮类化合物在菊科苦苣菜属中普遍存在。霍碧姗等[5]利用高效液相色谱,比较了苣荬菜、苦苣菜、长裂苦苣菜、南苦苣菜、花叶滇苦菜全草的黄酮含量(涉及槲皮素、木犀草素和芹菜素),推断黄酮含量较高的前3种植物药效可能高于后2种。另外,该属植物总黄酮在保肝[6]、抗氧化[7-8]方面的生物活性均得到了证实。目前,未见花叶滇苦菜地上和地下部分总黄酮提取工艺与生物活性的研究报道。微波辅助提取法是近年来发展起来的一种高效提取活性物质的方法,具有缩短提取时间、降低能耗等优势,对提取设备要求低,更易于实现产业化[9-11]。花叶滇苦菜作为入侵植物,资源非常丰富,而该属植物黄酮提取工艺的研究主要集中在苦苣菜和苣荬菜,很少涉及到花叶滇苦菜[5],因此,本文以花叶滇苦菜地上部分和地下部位为研究对象,研究其总黄酮的提取工艺,在此基础上,探究其总黄酮提取液乙酸乙酯萃取物的抑菌活性,为该资源的合理开发利用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

花叶滇苦菜 野外采集,分地上部分(茎叶)和地下部分(根),室外(约25 ℃)阴干至恒重,分别用打粉机打粉,过40目筛,备用;所有供试菌种 由丽水学院医学与健康学院提供;芦丁(HPLC≥98%) 北京世纪奥科生物技术有限公司；硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇 均为分析纯,天津市大茂化学试剂厂；亚硝酸钠 浙江省兰溪市化工试剂厂。

UV752N紫外可见分光光度计 上海精科实验仪表有限公司;SHZ-95B真空泵 上海鹰迪仪器设备有限公司;Grant SUB Aqua 12 Plus水浴锅 Grant Instruments(Cambridge)Ltd;Galanz P70F20CN3P-SR(WO)型微波炉 广东格兰仕微波生活电器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 花叶滇苦菜总黄酮的提取及乙酸乙酯萃取物的制备 微波辅助参考王赵改等[10]的方法,取花叶滇苦菜不同部位粉末5 g,放入直径为9 cm 的玻璃培养皿中,用蒸馏水湿润均匀。静置一段时间后放入功率可调的微波炉中进行预处理。将预处理好的样品放入锥形瓶中,加入一定浓度的乙醇溶液恒温水浴提取一段时间,抽滤除渣,得黄酮提取液,总黄酮得率待测。

将黄酮提取液用乙酸乙酯萃取3次,取乙酸乙酯萃取相,用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯,得到乙酸乙酯萃取物。

1.2.2 花叶滇苦菜总黄酮的测定 总黄酮含量测定采用硝酸铝显色法[12]。用紫外-可见分光光度计于510 nm处测吸光度,根据回归方程,计算总黄酮浓度。

其中:a为稀释倍数;v为提取液体积,mL;c为提取液总黄酮的浓度,mg/mL;w为花叶滇苦菜不同部位粉末质量,5 g。

1.2.3 花叶滇苦菜总黄酮提取条件单因素实验 以总黄酮得率为指标,选择以下8个因素进行单因素实验。分别是汽化剂用量、浸润时间、微波功率、微波时间、乙醇浓度、料液比、水浴温度、水浴时间。

1.2.3.1 地上部分提取单因素实验 固定微波功率420 W、微波时间60 s、乙醇浓度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴温度60 ℃、水浴时间30 min、浸润时间5 min,考察不同汽化剂用量(0、2.5、7.5、15.0、20.0 mL)对总黄酮得率的影响;固定汽化剂用量2.5 mL、微波功率420 W、微波时间60 s、乙醇浓度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴温度60 ℃、水浴时间30 min,考察不同浸润时间(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 min)对总黄酮得率的影响;固定微波时间60 s、乙醇浓度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴温度60 ℃、水浴时间30 min,浸润时间5 min、汽化剂用量2.5 mL,考察不同微波功率(350、420、490、560、630、700 W)对总黄酮得率的影响;固定乙醇浓度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴温度60 ℃、水浴时间30 min,浸润时间5 min、汽化剂用量2.5 mL、微波功率420 W,考察不同微波时间(0、30、60、90、120、150 s)对总黄酮得率的影响;固定料液比1∶30 g/mL、水浴温度60 ℃、水浴时间30 min,浸润时间5 min、汽化剂用量2.5 mL、微波功率420 W、微波时间90 s,考察不同乙醇浓度(30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%)对总黄酮得率的影响;固定水浴温度60 ℃、水浴时间30 min,浸润时间5 min、汽化剂用量2.5 mL、微波功率420 W、微波时间90 s、乙醇浓度60%,考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)对总黄酮得率的影响;固定水浴时间30 min,浸润时间5 min、汽化剂用量2.5 mL、微波功率420 W、微波时间90 s、乙醇浓度60%、料液比1∶30 g/mL,考察不同水浴温度(40、50、60、70、80 ℃)对总黄酮得率的影响;固定浸润时间5 min、汽化剂用量2.5 mL、微波功率420 W、微波时间90 s、乙醇浓度60%、料液比1∶30 g/mL、水浴温度70 ℃,考察不同水浴时间(30、60、90、120、150、180 min)对总黄酮得率的影响。

1.2.3.2 地下部分提取单因素实验 固定浸润时间5 min、微波功率420 W、微波时间90 s、乙醇浓度60%、料液比1∶30 g/mL、水浴温度70 ℃、水浴时间30 min,考察不同汽化剂用量(0、2.5、7.5、15.0、20.0 mL)对总黄酮得率的影响;固定微波时间90 s、乙醇浓度60%、料液比1∶30 g/mL、水浴温度70 ℃、水浴时间30 min,汽化剂用量0 mL,考察不同微波功率(350、420、490、560、630、700 W)对总黄酮得率的影响;固定乙醇浓度60%、料液比1∶30 g/mL、水浴温度70 ℃、水浴时间30 min,汽化剂用量0 mL、微波功率420 W,考察不同微波时间(0、30、60、90、120、150 s)对总黄酮得率的影响;固定料液比1∶30 g/mL、水浴温度70 ℃、水浴时间30 min,汽化剂用量0 mL、微波功率420 W、微波时间90 s,考察不同乙醇浓度(30%、40%、50%、60%、70%、80%)对总黄酮得率的影响(选择的梯度已经有明显的变化趋势,与地上部分浓度选择略有差异);固定水浴温度70 ℃、水浴时间30 min,汽化剂用量0 mL、微波功率420 W、微波时间90 s、乙醇浓度60%,考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)对总黄酮得率的影响;固定水浴时间30 min,汽化剂用量0 mL、微波功率420 W、微波时间90 s、乙醇浓度60%、料液比1∶30 g/mL,考察不同水浴温度(40、50、60、70、80、90 ℃)对总黄酮得率的影响;固定汽化剂用量0 mL、微波功率420 W、微波时间90 s、乙醇浓度60%、料液比1∶30 g/mL、水浴温度70 ℃,考察不同水浴时间(30、60、90、120、150、180 min)对总黄酮得率的影响。

表1 正交实验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

考虑到地下部分单因素实验中最佳汽化剂用量为0,因此去除对浸润时间的优化。

1.2.4 花叶滇苦菜总黄酮提取正交试验 根据单因素实验结果设计因素水平,以总黄酮得率为响应值,进行8因素3水平(地上部分)和7因素3水平(地下部分)实验设计。实验因素和水平见表1。考虑到地下部分单因素实验中最佳汽化剂用量为0,因此去除浸润时间的优化。

1.2.5 花叶滇苦菜总黄酮提取液乙酸乙酯萃取物的抑菌活性测定 抑菌实验参考标准参照CLSI标准[13],测定总黄酮提取液乙酸乙酯萃取物对铜绿假单胞菌(ATCC9027)及其耐药菌(PA1)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)及其耐药菌(SA1)、大肠杆菌(ATCC25922)的抑菌活性。

1.3 数据处理

正交表设计及极差分析由Minitab18完成;方差分析由Spss 16.0完成。

2 结果与分析

2.1 黄酮标准曲线制作

由图1可知,黄酮标准曲线方程为y=9.1875x+0.0094,R2=0.9987,线性关系良好。

图1 黄酮标准曲线Fig.1 Standard curve of flavonoids

2.2 总黄酮提取工艺单因素实验结果

由图2可知,地上部分汽化剂用量为2.5 mL时,黄酮得率达到了最佳。而地下部分最佳汽化剂用量为0 mL,可能是因为汽化剂用量的增加,使粉末收到的单位微波能量下降,微波效果降低[14]。由图3可知,当浸润时间超过5 min时,黄酮得率逐渐下降,因此,最佳浸润时间为5 min。由于地下部分的最佳汽化剂量为0 mL,因此浸润时间不考虑。由图4可知,微波功率为420 W时,黄酮得率达到最大,因此地上和地下部分的最佳功率均为420 W。由图5可知,微波时间对总黄酮的得率均有一定的影响,最佳时间为90 s。微波功率和微波时间的进一步增加会对黄酮产生破坏作用,从而降低其得率[15]。由图6可知,当乙醇浓度超过60%时,黄酮得率随着浓度升高逐渐降低,因此地上和地下部分的最佳乙醇浓度为60%时。黄酮得率在高浓度乙醇条件下反而降低,这与高浓度乙醇自身的挥发性以及高浓度乙醇会溶解色素、脂溶性等物质密切相关[16]。由图7可知,当料液比为1∶30 g/mL时,黄酮得率达到最佳。由图8可知,随着温度的升高黄酮得率逐渐升高,但是当水浴温度超过70 ℃以后,得率逐渐下降,这与高温会破坏黄酮有关[17]。因此,水浴温度70 ℃为最优条件。由图9可知,随着水浴时间的延长,黄酮得率反而降低,方差分析显示,30 min时的黄酮得率与90、120、150、180 min时的黄酮得率均存在显著差异(F=17.499,P<0.05)。前期微波预处理已经使花叶滇苦菜的细胞壁充分被破坏,在水浴30 min时,大量黄酮类物质被溶出,并且达到平衡,水浴时间的进一步增加反而会使黄酮中的一些热敏性物质遭到破坏,乙醇挥发也增加,进而影响黄酮得率[18]。因此,在微波条件下,水浴时间30 min是提取的最佳时间。而0～30 min水浴时间内的黄酮得率变化有待于进一步试验。

图2 汽化剂用量对总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of vaporization solvent mass on flavonoid yield

图3 浸润时间对总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of wetted time on flavonoid yield

图4 微波功率对总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of microwave power on flavonoid yield

图5 微波时间对总黄酮得率的影响 Fig.5 Effect of microwave time on flavonoid yield

图6 乙醇浓度对黄酮得率的影响Fig.6 Effect of ethanol concentration on flavonoid yield

图7 料液比对总黄酮得率的影响Fig.7 Effect of ratios of material to water on flavonoid yield

图8 水浴温度对总黄酮得率的影响Fig.8 Effect of water bath temperature on flavonoid yield

图9 水浴时间对总黄酮得率的影响Fig.9 Effect of water bath time on flavonoid yield

2.3 正交试验结果

2.3.1 地上部分总黄酮提取正交优化结果及验证实验 在正交试验3中,当汽化剂用量0 mL,微波辐射时间为120 s,浸润时间为10 min,微波功率为350 W,乙醇浓度为60%,水浴提取温度70 ℃,水浴提取料液比1∶40 g/mL,水浴提取时间为60 min时,花叶滇苦菜地上部分的黄酮得率为38.328 mg/g,为正交最优值。极差分析结果显示,对黄酮得率的影响大小顺序为:浸润时间>乙醇浓度>水浴温度>微波功率>水浴时间>汽化剂用量>微波时间>料液比(见表2)。

表2 花叶滇苦菜地上部分正交试验结果Table 2 Orthogonal test results of Sonchus asper aerial parts

以各因素下均值最高的作为该因素的水平,得到一个组合,即浸润时间10 min、气化剂用量7.5 mL、微波功率350 W、微波时间120 s、乙醇浓度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴温度80 ℃、水浴时间60 min,在此条件下进行验证实验。此条件下黄酮提取率为36.937 mg/g。因此,取正交试验3条件为最优工艺。

2.3.2 地下部分总黄酮提取正交优化结果及验证实验 地下部分正交实验中,当汽化剂用量0 mL,微波功率为490 W,微波时间为120 s,乙醇浓度为70%,料液比为1∶40 g/mL,水浴温度80 ℃,水浴时间为90 min时,其黄酮得率为7.111 mg/g,由极差分析可知,在对黄酮得率影响大小顺序为汽化剂用量>微波时间>水浴温度>料液比>乙醇浓度>微波功率>水浴时间(见表3)。

以各因素下均值最高的作为该因素的水平,得到一个组合,即汽化剂用量0 mL、微波功率490 W、微波时间90 s、乙醇浓度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴温度80 ℃、水浴时间90 min,在此条件下进行验证实验。此条件下黄酮得率为7.232 mg/g。因此,该工艺条件为最优工艺。

表3 花叶滇苦菜地下部分正交试验结果Table 3 Orthogonal test results of Sonchus asper underground parts

表5 不同浓度下花叶滇苦菜地下/地上部分总黄酮提取液乙酸乙酯萃取物的抑菌活性Table 5 Antimicrobial activity of ethyl acetate extracts of total flavonoids extract from underground and aerial parts of Sonchus asper

2.3.3 与传统提取方法的比较 由表4可知,花叶滇苦菜地上部分正交处理的黄酮得率为38.328 mg/g,比单因素实验的最优组合要高出7.652%;经过微波处理后(正交处理)的黄酮得率比传统水浴提取提高了12.415%。而花叶滇苦菜地下部分微波辅助的黄酮得率相较于传统的水浴提取提高了118.028%。

表4 微波处理法与传统提取法的比较Table 4 Comparison of microwave processing and traditional extraction

2.4 花叶滇苦菜总黄酮提取液乙酸乙酯萃取物的抑菌活性

抑菌结果显示,地上部分乙酸乙酯萃取物的活性较好,对金黄色葡萄球菌耐药菌的MIC为4.0 mg/mL,优于地下部分的8.0 mg/mL。当乙酸乙酯萃取物的浓度为16.0 mg/mL以下时,对其它3种细菌均没有抑制效果。

3 讨论与结论

本研究比较了去除微波辐射预处理前后的总黄酮得率,结果表明,在微波辐射预处理下,地上部分总黄酮得率提高了12.415%,地下部分总黄酮得率提高了118.028%。另外,地下部分提取水浴时间仅需要30 min,进一步证实了经过微波辐射预处理提高了后续提取的效率[10]。研究表明花叶滇苦菜中的黄酮类物质含量较苦苣菜低[5],安卓等[7]利用超高压法提取苦苣菜中的总黄酮,得率仅为5.753 mg/g,其结果远低于本研究微波辐射预处理提取得率38.328 mg/g(地上部分)和7.232 mg/g(地下部分),进一步证明了微波辐射预处理的优越性,逐渐成为一种理想的植物活性物质提取方法[19]。

在微波预处理提取的因素中,汽化剂用量对不同部位的总黄酮得率影响存在差异,其中地下部分的汽化剂用量为20 mL时,其黄酮得率处于极低的水平,可能是用量过多吸收了绝大部分微波。较高的微波功率和较长的时间均能对总黄酮产生破坏,从而影响其提取率。上述结论与王赵改等[10]的研究结论一致。

花叶滇苦菜总黄酮提取液乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌及其耐药菌抑菌效果较强,其MIC值不超过8 mg/mL。抑菌效果远优于杭白菊乙酸乙酯提取物(60 mg/mL)[20]、飞机草总黄酮提取物(15.6 mg/mL)[21]和油樟叶总黄酮(16 mg/mL)[22]的抑菌效果。今后,有望在分离、纯化抑菌活性成分等方面做进一步研究。