低温胁迫下淡色库蚊体内蛋白表达的双向电泳分析

马荣,刘丽娟

淡色库蚊是重要的疾病传播媒介，可传播班氏丝虫病以及流行性乙型脑炎等蚊媒传染病，在中国主要分布于长江以北地区[1，2]，以雌成蚊滞育越冬，越冬期从10 月中下旬开始到第二年3月中旬结束[3]。越冬蚊不仅在媒介蚊虫种群延续中发挥着重要的作用，而且可作为病原体的宿主，解除滞育后，仍然具有较高的传播能力，间接延长蚊媒病毒的传播周期[4-6]。淡色库蚊是变温动物，其生长发育易受外界环境条件的影响，对于越冬代蚊虫来说，冬季低温是影响种群延续发展的重要因素之一。在长期的进化过程中，媒介蚊虫应对低温环境产生了一系列的应对措施，对外寻找隐蔽场所躲避低温，对内改变物质组成应对低温的迫害[7-9]。研究发现，蛋白质在昆虫的滞育和越冬过程中发挥了重要的作用[10，11]，因此，研究低温胁迫对淡色库蚊体内蛋白质的影响，有助于探索淡色库蚊的抗寒机制。本研究以室内饲养淡色库蚊为对照，利用双向电泳技术，对低温处理后淡色库蚊体内蛋白质表达谱进行分析，比较低温胁迫下，淡色库蚊体内蛋白质表达谱的差异，有望获得淡色库蚊的抗冻蛋白，为淡色库蚊越冬抗寒机制的研究提供数据支持。

材料和方法

1试验蚊虫

试验用淡色库蚊由山东省寄生虫病防治研究所医学昆虫学部提供。幼虫饲养条件:温度26℃±2℃，光周期为光照:黑暗=12L ∶12D，饲喂酵母粉和猪肝粉的混合饲料(1∶1)，成蚊羽化后饲喂5%的葡萄糖水。随机挑选部分雌成蚊作为处理组，转入温度10℃±2℃，相对湿度70%～80%的生化培养箱中饲养48 h后用于试验，未做处理的雌成蚊为对照组。

2试剂和仪器

IPG 胶条(GE公司)，非干扰型蛋白质浓度测定试剂盒(SK3071)、昆虫蛋白提取试剂盒(786-360)、2D电泳样品清洁试剂(786-124)、质谱银染试剂盒(BSP021)、蛋白质快速染色试剂盒(SK3011)、考马斯亮蓝(G-250)、硝酸银、溴酚蓝、低熔点琼脂糖、分析纯无水乙醇、乙酸、氨水、甲醛等均为生工生物产品；SDS、GLYCINE、TRIS、ACRYMIDE、BIS、GLYCEROL APS、TEMED(BIO-RAD)、Urea、Thiourea、CHCA为Sigma 产品，乙腈、三氟乙酸为Merck 产品。

分光光度仪(UV1800，美谱达仪器公司)，纯水装置(摩尔公司)，超声细胞破碎仪(浙江新芝)，电泳仪(SE-600全套电泳设备、光密度扫描仪、冷却水循环系统、软件分析:ImageMasterTM 7.0(GE公司)，质谱仪(4800 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer)(Applied Biosystems，USA)。

3蛋白质的提取和浓度测定

淡色库蚊蛋白质提取方法参照昆虫蛋白提取试剂盒(786-360)。随机挑选处理组(A)和对照组(B)淡色库蚊雌成蚊各100只，称重，液氮研磨15 min，根据每100 mg 蚊虫组织对应500μL 的比例加入蛋白提取液，混匀后振荡20 min，12 000 g 离心10 min，取上清即为昆虫总蛋白。处理组和对照组均重复三次。样品溶液利用Perfect-FOCUSTM 2D电泳样品清洁试剂处理，利用非干扰型蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度，80μg 分装样品，-80℃保存。

4蛋白质的双向电泳

第一向等点聚焦IEF按照IPGphorTM系统指南进行。凝胶条选用pH 3-10，11 cm，上样量银染80μg，考染800μg，电泳参数:30 v-12 hrs；500 v-1 hr；1000 v-1 hr；8000 v-8 hrs；500 v-4 hrs。第二向SDS-PAGE电泳，凝胶浓度12.5%，电泳参数:15

mA/胶30 min；30 mA/胶至溴酚蓝离胶下沿0.5 cm。考马斯亮蓝染色操作步骤参照蛋白质快速染色试剂盒进行。先用40%甲醇和10%冰乙酸的脱色液脱色三次，每次20 min，再用0.1%的冰乙酸脱色至背景干净。

5凝胶扫描和图像分析

扫描经考马斯亮蓝染色的2-DE胶图像，用ImageMasterTM 7.0 分析软件对图象进行图像加工、斑点检测、胶图匹配等分析，同时经过蛋白质点检出和归一化处理，对相同位置的蛋白质点进行定量分析，筛选低温处理组和对照组淡色库蚊雌成蚊蛋白质双向电泳图谱上表达量相差2 倍以上的蛋白点作为差异蛋白点。

6蛋白质的质谱鉴定

挑选低温处理组特有的14 个蛋白质点做质谱鉴定。切胶回收差异蛋白质点，并对蛋白质点进行胶内消化，银染染色操作步骤参照Protein Stains K质谱用快速银染试剂盒。取1μL 酶解样品直接点于样品靶上，让溶剂自然干燥，再取0.5μL 过饱和CHCA基质溶液点至对应靶位上自然干燥，样品靶经氮气吹净后放入仪器进靶槽进行质谱分析，数据处理由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

结果

1低温处理前后淡色库蚊SDS-AGE电泳

低温处理组淡色库蚊雌成蚊蛋白质浓度为8.5 μg/μL，对照组淡色库蚊蛋白质浓度为4.76μg/μL，二者差异有统计学意义(P＜0.05)。淡色库蚊雌成蚊低温处理组和对照组SDS-PAGE电泳图见图1，从图中可以看出，两组蛋白的差异条带较多，低温处理组淡色库蚊雌成蚊特有条带主要集中在18.4～66.2 kDa 之间。

图1淡色库蚊SDS-PAGE电泳图

2低温处理前后淡色库蚊雌成蚊双向电泳

图2低温处理前后淡色库蚊蛋白2-DE图谱

低温处理组和对照组淡色库蚊蛋白质双向电泳平均得到蛋白质点分别为2 807个和2 602 个(图2)。 将所有的差异点都标示在一张点最多的母胶上(图3)，经灰度比对，标记差异点，共发现2 倍以上差异点77个，其中超过5倍的差异点11个；低温处理组表达量上调的蛋白点30 个，表达量下调的蛋白点47个；低温处理组特有的蛋白点14个，分子量主要在25～60 kDa 之间。

图3低温处理前后淡色库蚊蛋白的双向电泳图谱

3质谱分析结果

本实验选择只在低温处理组中有表达而对照组中无表达的14个蛋白质点进行质谱分析(表1)，结果显示与媒介蚊虫相关的蛋白点有13个，其中成功鉴定肽段94条。经Mascot 搜索，NCBI数据库确认，共鉴定出25个差异表达蛋白质，主要为肌动蛋白、醛糖还原酶、肌球蛋白重链、苹果酸脱氢酶、精氨酸激酶、磷酸丙糖异构酶、ATP 合酶D链、dj-1蛋白质、酯酶B11、ATP 合酶-线粒体亚基、磷酸甘油酸变位酶、LIM domain-binding 蛋白质、原肌球蛋白、果糖-二磷酸醛缩酶以及一些保守假设蛋白。这些蛋白多与细胞骨架的重塑、糖代谢、能量代谢和产生以及各种合成、代谢酶有关。

讨论

本研究通过对低温处理组和对照组蛋白质含量的测定，结果发现低温处理后淡色库蚊体内蛋白质含量较对照组显著增加，可见蛋白质在淡色库蚊躲避低温迫害过程中发挥了重要作用，结合文献资料[12，13]，进一步证实蛋白质可以增强淡色库蚊的抗寒能力。利用双向电泳技术，检测到低温处理组与对照组2 倍以上差异点77个，低温处理组表达量上调的蛋白点30个，特有的蛋白点14个，说明低温胁迫下，淡色库蚊体内蛋白质表达水平发生了很大的变化，低温可能诱导部分抗冻蛋白的产生和积累。经质谱鉴定分析，发现在低温胁迫下，淡色库蚊体内发生变化的蛋白质多与细胞骨架的重塑、糖代谢、能量代谢和产生，以及各种合成、代谢酶有关，该结果与淡色库蚊越冬滞育蚊体内蛋白质的变化相一致[14]，进一步证明低温是诱导淡色库蚊越冬滞育的重要条件之一。

表1低温处理组淡色库蚊特有蛋白的质谱分析结果

该研究结果显示低温可诱导淡色库蚊体内蛋白质含量和表达的变化，由于实验未设置多时间段低温处理对比，可能造成一些与信号传导相关的蛋白以及转录因子类的蛋白没有被检测到。据文献报道，越冬代淡色库蚊体内蛋白质含量在越冬早期呈增加趋势，越冬中后期含量下降，蛋白质含量在不同的越冬时期会有不同程度的变化[15]。因此，下一步应重点探索不同低温处理时间淡色库蚊体内蛋白质组成和含量的变化，寻找与抗寒性相关的蛋白质即抗冻蛋白，为媒介蚊虫越冬机制的研究提供更新支持。