基于核糖体DNA第二内转录间隔区基因的9种蚊虫分子鉴定

郭秀霞,程鹏,刘丽娟,王海防,王怀位,张崇星

蚊虫是重要的医学昆虫，除吸血骚扰人类外，还是疟疾、登革热、乙型脑炎等重要传染病的传播媒介。全世界已知蚊虫共41属201亚属3 773种，由于隐存种的广泛存在，实际种数应是已定名种数的3～5倍[1，2]。开展蚊媒种属遗传变异研究和分子鉴别对于蚊媒疾病的防治具有重要意义。目前常用于蚊虫种属分类方法主要有形态学鉴定和分子鉴定，其中多拷贝的核糖体DNA是在蚊虫近缘种的鉴别和系统关系分析中应用较为成功和理想的分类指标[3]。研究表明，蚊虫rDNA 单位有18S、5.8S、28S RNA编码区、基因间隔区(ICS)、第l 和第2转录间隔区(ITSl、ITS2)、外转录间隔区(EST)组成，编码区和间隔区的进化速率不同，在亲缘关系密切的种间，编码区的序列高度保守，而非编码区如基因间隔区和内转录间隔区的序列存在差异，其中ITS区不加入成熟核糖体，受到选择压力小，进化的速率较快，因此可以从其序列中得到较多的信息[4]。本研究对山东省济宁市9种常见蚊虫rDNA-ITS2基因序列进行分子鉴定，为今后蚊虫种类分子鉴定方法探讨提供依据。

材料与方法

1材料

1.1蚊虫样本2017年7月中旬采用传统的蚊媒密度监测方法人饵帐诱捕蚊法在山东省济宁市北湖地区采集成蚊样本，采集的蚊虫带回实验室进行形态学鉴定。

1.2试剂与设备dNTP、LA Taq聚合酶、DNA分子质量标准(DL-2000、1kbp Ladder)购自日本TaKaRa 公司。PCR 产物纯化试剂盒购于美国Axygen公司。T-Gradient Thermoblock PCR扩增仪购于德国Biometra 公司，Mini-ProteanTetra Cell 电泳仪和Smart Spec3000紫外分光光度计购于美国Bio-Rad公司。

2方法

2.1成蚊采集采用人饵帐诱捕蚊法，在室外悬挂单人蚊帐，固定四角，使帐下缘距离地面20～30 cm，傍晚及日落后15 min由一人于帐内开始诱捕蚊虫，每小时捕蚊45 min，至次日黎明止。形态学鉴定方法按照相关参考文献[5，6]进行。

2.2蚊虫基因组DNA 提取按相关文献[7]操作步骤，提取单蚊基因组DNA。将单个蚊虫置于1.5mL离心管中，加入100μL 预热的裂解液，用塑料研磨棒研磨至匀浆状。65℃孵育30 min，加5 mol/L(25μL)乙酸钾至终浓度1 mol/L，混匀，4℃置30 min。13 200 r/min(离心半径10 cm)离心10 min。取上清液100～110μL，注意不要抽到沉淀。加2～2.5倍体积预冷无水乙醇(-20℃)沉淀核酸，4℃静置30 min～3 h，13 200 r/min(离心半径10 cm)离心10 min。弃上清液，加75%乙醇200 ～300μL(-

4℃)洗涤盐分，弃上清液，37℃烘干。加50～100 μL 双蒸灭菌水溶解，置-20℃冰箱保存待用。紫外分光光度计测DNA浓度及纯度，1%琼脂糖凝胶电泳分析。

2.3 rDNA-ITS2基因的扩增与测序根据蚊虫rDNA-ITS2序列特征，在相对保守区域设计引物，引物由上海Invitrogen 贸易有限公司合成。上游引物:5'-GAACTGCAGGACACATGA-3'，与淡色库蚊28S前端编码区保守序列互补；下游引物:5'-GGGGTAGTCACACATTATTTG-3'，与淡色库蚊5.8S末端编码区保守序列互补。以提取的蚊虫DNA为模板，用上述引物进行PCR 扩增。采用50μL 反应体系:

ddH2O 38.5μL、10×LA PCR Buffer 5μL、10mmol/L dNTP 1μL、模板DNA 1μL、LA Taq聚合酶0.5 μL、10 pmol/L 上下游引物各2μL。反应条件:94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30个循环；最后72℃延伸5 min。取扩增产物5μL 进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察拍照记录结果。扩增成功样品送Invitrogen公司进行双向测序。

2.4数据分析采用Bioedit 7.0 软件对测序结果进行拼接处理，正反链序列结果一致的样本进行下一步分析。登陆GenBank 对序列进行Blast 同源性比对，不同个体rDNA-ITS2 序列用DNAMAN软件进行 序 列 比 对，用DNASTAR、ClustalX 1.81和Mega6软件进行序列分析。基于遗传距离Kimura 2-parameter 采用NJ法和UPGMA法构建系统进化树，系统树各分支的置信度由1 000次bootstrap重复检测。

结果

1成蚊种类

共捕获蚊虫6 属9种4 267只，其中淡色库蚊(Culexpipienspallens)2 954只、三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)563只、二带喙库蚊(Culexbitaeniorhynchus)9只、刺扰伊蚊(Aedesvexans)5只、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)38只、中华按蚊(Anopheles sinensis)463只、骚扰阿蚊(Armigeresobturbans)22只、黄色轲蚊(Coquillettidiaochracea)12 只和常型曼蚊(Mansoniauniformis)201只。

2蚊虫rDNA-ITS2基因克隆

9种蚊虫rDNA-ITS2 基因片段长度为200 bp与750 bp之间(图1)。

图1 9种蚊种的rDNA-ITS2基因PCR产物电泳结果

3 rDNA-ITS2 基因测序及序列分析

9种蚊虫的rDNA-ITS2基因片段长度在343 bp与577 bp之间，其中，中华按蚊的基因片段最长(577 bp)，黄色柯蚊的基因片段最短(343 bp)，淡色库蚊、二带喙库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、刺扰伊蚊、骚扰阿蚊、常型曼蚊的基因片段长度分别为:446 bp、371 bp、377 bp、489 bp、352 bp、387 bp、366 bp，所有序列均未发现碱基插入或缺失。rDNA-ITS2 基因片段中A、C、G、T 四种碱基的平均含量分别为26.2%、26.5%、24.4%、22.8%。A+T 碱基含量范围为46.0%～54.6%，平均49.0%。各蚊种A+T 碱基含量见表1。rDNA-ITS2 基因片段585个位点中有59个保守位点，449个变异位点，235个简约信息位点，191个单态位点。不同蚊种的rDNA-ITS2 序列同源性为28.21%～53.76%，其中库蚊属内(淡色库蚊、三带喙库蚊、二带喙库蚊)同源性为38.85%～66.49%，伊蚊属内(白纹伊蚊、刺扰伊蚊)同源性为40.76%，中华按蚊和二带喙库蚊的同源性最低(28.21%)。基于Kimura-2 参数法计算种间遗传距离，不同种群的遗传距离在0.240 ～1.154 之间。中华按蚊和二带喙库蚊之间的遗传距离最大，为1.154，淡色库蚊和三带喙库蚊之间的遗传距离最小，为0.240，属间遗传距离最小的为黄色柯蚊和白纹伊蚊，为0.428(表2)。

采用NJ法和UPGMA法构建系统进化树，所有系统数树支上数值为1 000次Bootstrap检测得到的对该支的支持百分数。从图中可以看出这两种不同的分子系统树具有大致相同的拓扑结构，库蚊属的淡色库蚊、三带喙库蚊和二带喙库蚊聚成一类，伊纹属的白纹伊蚊和刺扰伊蚊聚成一类，但这两个系统中，骚扰阿蚊、黄色柯蚊、常型曼蚊和中华按蚊的位置有所不同。在NJ树中，该四种蚊虫为独立分支，而UPGMA 树中，骚扰阿蚊和黄色柯蚊聚为一类(图2)。

表1 9蚊种的rDNA-ITS2基因片段碱基组成(%)

表2 9蚊种rDNA-ITS2基因序列的遗传距离

图2基于rDNA-ITS2基因序列构建的分子系统树(重复次数为1 000 次)

讨论

蚊虫隶属于节肢动物门、昆虫纲、双翅目，长角亚目蚊科，能够传播多种疾病，不同种的蚊虫能够携带和传播不同的病原体，是严重危害人类健康的重要昆虫。在蚊虫分类中，长期以来都是以形态特征作为分类依据，而利用形态特征进行分类具有一定的局限性，比如复合体和亲缘种的存在，以及现场采集蚊虫过程中造成的足断翅破、损毛失鳞等标本形态特征信息量不足等，使得单纯的形态分类难以进行。随着分子生物学技术的迅猛发展，出现了线粒体DNA、核糖体DNA、微卫星DNA、单核苷酸多态性(SNP)和限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性(RAPD)等多种分子遗传标记[8，9]。多拷贝的核糖体DNA是细胞核内编码rDNA的基因，以串联多拷贝的形式组成的多基因家族，其种间变异明显大于种内变异。每个拷贝由编码区和间隔区组成，两者的进化速率不同，在亲缘关系密切的种间，编码区高度保守，而非编码区序列多态性程度高，此外，rDNA分子量大小适中，信息量大，因此是蚊虫近缘种鉴别和序列分析的理想标志之一。rNDAITS2在生物界存在普遍性和多拷贝性，在个体和群体内具有较好的均一性，少量样本能有效代表群体的变异情况，是生物系统进化研究的一个非常有用的分子标志[10，11]。本实验室曾成功分析山东多个地区淡色库蚊的rDNA-ITS2基因多态性[12]。高琪等[13]利用rDNA-ITS2 基因对赫坎按蚊复种团内的中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊等4种近缘种进行鉴别，结果符合率达100%，较传统按蚊形态学鉴别方法更准确，特异性更高。师永霞等[14]利用rDNA-ITS2 对广东国境口岸的致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、骚扰阿蚊和中华按蚊进行分子鉴定，成功对蚊虫的亚科、属和种进行区分。

目前，蚊虫复合体成员种分子鉴别研究中应用rDNA 作为分类指标较多，大多数以ITS2为依据。本研究以济宁市采集的成蚊为材料，经过实验室传统形态学鉴定为6属9种。设计特异性引物PCR扩增成功获得rDNA-ITS2基因序列并进行序列分析。9种蚊虫的rDNA-ITS2 基因片段长度不同，同源性比较表明，不同蚊种的rDNA-ITS2 序列之间同源性为28.21%～53.76%，种间序列差异性高达46.24%～71.79%，这表明rDNA-ITS2 序列特征在种间具有一定差异，与师永霞等[14]的研究结果相一致。淡色库蚊和三带喙库蚊的同源性最高，中华按蚊和二带喙库蚊的同源性最低，遗传距离也同样显示淡色库蚊和三带喙库蚊的遗传距离最小，中华按蚊和三带喙库蚊之间的遗传距离最大。rDNA-ITS2基因的属间最小遗传距离0.428和种间最大遗传距离0.415接近。为了提高结果的可靠性，在分子系统发育研究中，通常同时合用多种方法构建系统树。本研究采用了NJ法和UPGMA法分别构树，并通过1 000次重抽样(bootstrap)来评估结果的可靠性。结果表明两种系统树均能区分较低分类阶元(属和种)的区分，但对各属间系统发育关系的区分有一定限制，其中NJ树的结构与与传统蚊虫形态学分类结果更为一致。然而，这与此前本实验室[15]利用线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mtDNA-COⅠ)基因对该9种蚊虫进行分子进化分析的结果并不一致，但基于rDNA-ITS2 的系统进化树表明，不同属种的蚊虫更明显位于对应的聚类分支上。因此，rDNA-ITS2基因可用于蚊虫分类鉴定，进一步的研究将对rDNA-ITS2氨基酸序列进行比较分析，同时综合利用多种分子遗传标记进行鉴定分析比较，弥补蚊虫传统分类系统的缺点，为蚊虫分类鉴别提供依据。