菌种活化操作方法

孙葳

菌种是我国重要的生物资源，保藏适当的菌种需要正确的活化方法来获得纯培养物，本文结合多年从事食品微生物检验的工作经历，简要介绍常规的菌种活化操作方法。

菌种活化就是将保藏状态的微生物菌种放入适合其生长繁殖的的培养物中进行培养，通过逐级扩大培养进而获得活力旺盛、数量足够的纯培养物。通常我们工作中使用的工作菌种需经过要2-3代的复壮过程，因为菌种的保存条件以及培养条件不尽相同，所以需要活化让菌种逐渐适应培养环境[1]。

一般菌种临时存放及活化方法

采用低温保存管保存菌种，应存放于-20℃ ～ -80℃的低温条件下。准备36±1℃的70-75﹪酒精浴槽（若以水浴取代，应确保所用水中微生物污染得到控制），事先应在浴槽放置小试管架或保存管架等，液面要低于管塞或管盖。将低温保存管从低温保存条件中取出，置于36±1℃的浴槽内的管架上。不断轻微摇动低温保存管，液面不可高至管塞，直至冰完全溶解（大概需要2min左右）。

无菌培养操作方法

用无菌微量吸管，从已溶解的低温保存管中吸取1-2滴菌液，滴入指定的固态培养基一边缘附近，以划线或涂布法接种于培养基。也可用灭菌金属环蘸取菌液后，以划线或涂布法接种于培养基。

待菌液吸收完全后，将接种好的培养基倒置放于指定温度的培养箱中进行培养。

平板划线分离操作方法

平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，所以要反复分离多次才可得到纯菌种。

手持金属接种环，将接种环（共约5公分）置于酒精灯外焰烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约10公分，等待几秒钟后，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶，待接种环彻底冷却后，沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划，直到涵盖1/3培养基为止。

灼烧接种环，冷却后，旋转培养基自1区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域。

重复2的动作完成。

灼烧接种环，将接种环归位。

一般操作过程

以无菌操作，用无菌微量吸管，从已溶解的管中吸取50μL（或1-2滴）的菌液，滴入固态指定培养基某一边缘附近，以划线法接种于培养基。

將接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。

对于常规细菌应用无菌吸管，吸取0.3-0.5mL指定的液体培养基，滴入内管中，并轻微震荡（也可用该吸管反复吹打协助），直至均匀悬浮。

对于霉菌、酵母菌应用无菌吸管，吸取0.3-0.5mL无菌水，滴入内管中，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5mL无菌水的小试管内，轻微震荡均匀后，静置30-60min。

取0.1-0.2mL菌体悬浮液滴于平板培养基上，划线分离培养或做成一系列的稀释，用无菌L棒均匀涂布，检验菌种的纯度及活化情况，剩余的菌液则全部移入相应的液体培养基内，按指定的温度进行培养。

某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期可能较长，必须培养二倍时间后才可长出，且再经过一、二次继代培养后才能正常生长。若经以上方法处理后仍培养失败，则视为不能活化。

参考文献：

[1]陈丽湘.冻干菌种复活、保藏方法探讨.蛇志[J].2007，19，1.

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