线粒体DNA甲基化的研究进展

曹珈琪 林文 丁磊 张宜林 崔清华

[摘要]DNA甲基化是在DNA甲基转移酶（DNMTs）的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，催化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点（CpG），即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点，一般称为CpG岛，中胞嘧啶位点共价结合甲基基团转化为5-甲基胞嘧啶，是表观遗传修饰的重要方式之一。研究已证实核基因组中DNA甲基化的改变与许多复杂疾病有关。近来，线粒体DNA（mtDNA）甲基化也正在受到越来越多的关注，尤其是mtDNA甲基化在疾病及线粒体基因调控中的重要作用。本文对核基因组与线粒体DNA甲基化的关系进行简要介绍，并介绍了影响mtDNA甲基化的相关因子以及mtDNA甲基化与神经退行性疾病，癌症等疾病的联系，对产生的潜在影响以及作用机制等进行概述。

[关键词]线粒体;甲基化;线粒体DNA;神经退行性疾病;癌症

[中图分类号] R722.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）2（c）-0017-05

Research progress in mitochondrial DNA methylation

CAO Jia-qi1，2   LIN Wen1，2   DING Lei1，2   ZHANG Yi-lin1，2   CUI Qing-hua1，2

1. Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology， School of Life Sciences， Yunnan University， Kunming   650500， China; 2. Key Laboratory for Biochemistry and Molecular Biology of Yunnan Colleges and Universities， Yunnan Province， Kunming   650500， China

[Abstract] The epigenetic alteration centered around the DNA methylation modification of cytosine phosphate guanine （CpG） islands. The DNA methylation associated with the addition of a methyl group that is from s-adenosylmethionine （SAM） to a cytosine base in the dinucleotide sequence CpG islands catalyzed by DNA methyltransferases （DNMTs）， and involved in many complex diseases clinical management. Recently， many studies focused on the mitochondrial DNA （mtDNA） methylation， especially the vital role associated with the mitochondrial gene regulation and the mitochondrial related diseases. This review briefly summarized the relationship between mitochondrial DNA methylation and nuclear genome， furthermore， this review also introduces the factors related to mtDNA methylation and many diseases related to mtDNA methylation， such as neurodegenerative diseases and cancer. As well as the potential impacts and mechanisms of mtDNA methylation involve in these diseases.

[Key words] Mitochondria; Methylation; Mitochondrial DNA; Neurodegenerative disease; Cancer

線粒体作为真核细胞内部最重要的细胞器之一，通过氧化磷酸化生成ATP，供给细胞行使各种生命活动所需要的能量并参与脂肪酸的合成及某些蛋白质的合成，且在细胞周期及细胞程序性死亡中具有重要调控作用[1]。线粒体是一种半自主的细胞器，有自身独特的DNA和遗传密码[2]。mtDNA有16 569碱基对，是由一条重链（H链）和一条轻链（L链）构成的闭合环，两条链均具有独立编码区和非编码区[3]。编码区共编码37个基因，其中H链负责大部分的编码工作，包括12个氧化磷酸化系统蛋白，2个核糖体RNA分子（rRNA 12S和16S）以及14个tRNA;L链则编码另外8个tRNA和一个氧化磷酸化系统蛋白。非编码区则包含了H链的复制起点、H链和L链的转录启动子D环（D-loop）区，是线粒体DNA（mtDNA）复制和转录的调控中心，其突变可以引起许多线粒体疾病[4]。近年来，mtDNA的甲基化在线粒体基因表达中的调控作用受到更多关注，甲基化异常与多种疾病相关。

1核基因组DNA的甲基化

核基因组DNA甲基化是表观遗传的重要方式之一，主要通过对基因启动子区的甲基化修饰参与基因表达调控[5]，是在DNA甲基转移酶（DNMT）的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸（SAM）為甲基供体，将甲基转移到特定碱基的过程[6]。哺乳动物有三种主要的核基因组DNA甲基转移酶：DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。DNMT1是最丰富的甲基转移酶，活跃在整个成年期，维持生物体的DNA甲基化活性和模式[7];DNMT3A和DNMT3B可使去甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点（CpG）重新甲基化。此外，DNMT2负责将甲基基团转移到RNA而不是DNA[8];DNMT3L是DNMT3A的一个重要的调节辅因子[9]。

2 mtDNA甲基化

mtDNA是否受到甲基化修饰一直存在争议[10-14]。1971年，研究人员发现泥鳅胚胎线粒体中含有5-甲基胞嘧啶（5-mC）形成所必需的DNMT，表明mtDNA极可能存在甲基化修饰现象。1974年证实牛心肌线粒体中也存在5-mC[15]。2011年，在线粒体中发现了与核DNMT1同型的线粒体亚型DNMT1（mtDNMT1），证实了mtDNMT1与线粒体的D环控制区结合并形成5-mC，调控线粒体基因表达，且mtDNMT1与线粒体基因组结合的方式与CpG二核苷酸的密度成正比[16]。DNMT3A也在线粒体中被发现，特别是在病理性神经退行性疾病条件下[17]。此外，最近的一项研究表明线粒体也可能含有DNMT3B[18]，但是这两种酶在mtDNA甲基化中的作用尚不清楚。

3核基因与线粒体DNA甲基化的关系

线粒体和核基因组DNA密切沟通和互动，二者共同调节代谢和凋亡途径[19]。核基因组主导的表观遗传改变可通过调节线粒体基因的表达来影响线粒体功能，细胞中特定的mtDNA拷贝数和活性变化也可以影响核基因的甲基化模式和甲基化水平，从而调控核基因的表达，参与分化和发育[20]。

4 mtDNA甲基化研究进展

4.1饮食和环境与mtDNA甲基化

近期研究表明，饮食与药物会对mtDNA甲基化产生一定程度的影响。研究人员以橄榄油、紫苏油等不同食用油脂饲喂大黄鱼，不同的油脂饲喂会对大型黄鱼mtDNA的甲基化情况产生影响，进而影响其线粒体功能[21]。研究人员给予4周龄雄性大鼠20%果糖溶液连续14周，然后检测其肝脏mtDNA甲基化（5-mC和5-hmC）及RNA水平发现：果糖喂养大鼠的肝脏mtDNA整体低甲基化，且含量和转录水平均高于对照组[22]。Jia等[23]发现，低蛋白饮食和增加甜菜碱摄入均会对仔猪mtDNA甲基化产生影响。妊娠期母猪低蛋白饮食与标准蛋白饮食相比，其雄性后代糖皮质激素受体与mtDNA启动子结合程度更高，且呈现较低的胞嘧啶甲基化和羟甲基化;但在雌性后代中观察到相反的变化，即表现为性别依赖的线粒体表观遗传。而妊娠期间的母体甜菜碱补充则会通过仔猪骨骼肌线粒体D-loop区低甲基化增强mtDNA基因的表达。另外一项在接受口服核苷类药物（NAs）治疗的乙肝患者的研究中揭示，与未治疗的患者及健康对照相比，用NAs治疗患者中的mtDNMT1表达增强，胞嘧啶残基的甲基化发生率更高[24]。

另外，环境中地下水砷污染由于其对人类健康的不利影响而成为全球关注的焦点。一项病例对照研究发现砷暴露与mtDNA甲基化差异相关，与健康人群相比，地下水砷污染患者线粒体D-loop区及线粒体复合物I-NADH脱氢酶第6亚基（ND6）呈现显著的低甲基化，同时靶基因高表达[25]。研究人员对瑞典南部职业暴露于粉尘中的焊工与健康对照比较发现，焊工的mtDNA拷贝数更高，D-loop和mtDNA甲基化程度更低，且血压更高。在镀铬工人的血液研究中也发现了类似现象，镀铬工人血铬浓度与线粒体编码苯丙氨酸12SrRNA基因（MT-TF/RNR1）甲基化呈现负相关[26-27]。此外，胎盘mtDNA甲基化与妊娠期间PM 2.5暴露成正相关，特别是在妊娠早期[23]。吸烟也会引起mtDNA甲基化的异常，研究证实怀孕期间的母亲吸烟会导致胎盘中线粒体D-环区及L链DNA高甲基化，同时新生儿包皮线粒体中D-loop区及H链的DNA高甲基化，因此母亲妊娠期吸烟可能通过mtDNA甲基化影响新生儿健康[28]。

线粒体是细胞氧化应激的来源和靶点，mtDNA与活性氧（ROS）来源的接近，使mtDNA更容易受到饮食、药物、或环境因素的影响[29]。

4.2神经退行性疾病与mtDNA甲基化

mtDNA甲基化随着人大脑的衰老而增加，其中M1215和M1313这两个CpG位点在预测和实际年龄之间显示出更强的相关性，有望成为法医年龄预测和健康状况测量的可用生物标志物[30]。mtDNA的表观遗传修饰可能与神经退行性疾病相关，如肌萎缩侧索硬化（ALS）、帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）和其他神经退行性疾病中。ALS组织的核DNA发生表观遗传修饰，但mtDNA的表观遗传修饰仍然知之甚少。近期研究显示ALS患者线粒体D-loop区甲基化水平与mtDNA拷贝数负相关[31]。ALS转基因小鼠的脊髓神经元和骨骼肌肌原纤维中编码16S rRNA的线粒体基因发生甲基化[32]。在AD患者脑组织的内嗅皮质中，mtDNA中D-loop区5-mC水平增加，并且在小鼠模型中也得到证实[33]。在PD患者黑质中D-loop区5-mC水平显著低于对照样本。以上结果表明人脑中mtDNA的D-loop区表观遗传修饰与神经退行性疾病相关[31-34]。

4.3 mtDNA甲基化与癌症

mtDNA的复制受到严格监管，不同类型细胞其mtDNA拷贝数也不同，以便分化的细胞能够获得足够的mtDNA拷贝以满足其特定的能量需求[35]。许多癌细胞类型维持较低的mtDNA拷贝数，由于其主要依靠有氧糖酵解产生能量，促进细胞增殖而舍弃细胞分化能力[36]。mtDNA去甲基化可能会提供额外的模板来促进mtDNA的复制，增加拷贝数[37]。为了确定mtDNA甲基化在肿瘤发生过程中对mtDNA复制的调节程度，研究人员使用胶质母细胞瘤和骨肉瘤的肿瘤模型表征了mtDNA甲基化的模式，在具有相同的核基因组背景，但具有mtDNA基因型以及拷贝数的不同组合的肿瘤模型中发现：首先，在相同核基因组背景下，mtDNA较高水平的5-mC与143B肿瘤模型中mtDNA拷贝数的相对受限的扩增相关。其次，相同的mtDNA基因型在不同核基因组的影响下表现不同，以调节mtDNA甲基化。第三，mtDNA甲基化水平在肿瘤进展期间趋于减少，这可能有助于mtDNA拷贝的增加。并且，在143B模型细胞的肿瘤发生过程中，DNA甲基化水平的变化与线粒体复合物I-NADH脱氢酶第5亚基（ND5）和ND6的转录变化相关，这可能表明mtDNA甲基化会对原发性多顺反子转录产生影响[38]。结直肠癌中也有研究表明，在结直肠癌组织中线粒体D-环区的甲基化水平明显低于相应的非癌组织，线粒体D-环区域的去甲基化伴随着mtDNA拷贝数的升高，并且结直肠癌组织中基因线粒体复合物I-NADH脱氢酶第2亚基（ND-2）的表达同时增加，推测线粒体D环区域的突变或表观遗传修饰可能影响mtDNA复制并改变mtDNA的表达模式。总之，在结直肠癌组织中，线粒体D-环区的去甲基化率，mtDNA拷贝数和ND-2表达显着高于相应的非癌组织中的去甲基化率，D-环区的去甲基化可能涉及mtDNA拷贝数和ND-2表达的调节[39-41]。另外一项研究也指出，在线粒体D环区启动子CpG岛上特定位点的去甲基化可能导致结直肠癌中mtDNA拷贝数的升高，并引发细胞增殖增加，细胞凋亡减少和相对细胞周期停滞[42]。这些发现为mtDNA甲基化及其在肿瘤发生中mtDNA拷贝数的表观遗传调控中的作用提供了新的见解。

结直肠癌腺瘤，作为从正常粘膜到结直肠癌的早期可检测组织类型，是预防和干预的重要靶点[43]，因此近期一项腺瘤研究发现，mtDNA中的甲基化水平在正常組织和腺瘤组织之间没有显著差异，而且线粒体基因组中确实存在特定位点的低水平甲基化，但它与腺瘤中的线粒体基因转录变化无关，此外，由于未观察到mtDNA甲基化的大规模变化，因此结直肠癌腺瘤中mtDNA的甲基化状态并不能作为早期结直肠癌合适生物标志物[44]。

4.4 mtDNA甲基化与其他疾病

mtDNA甲基化可能与胎盘功能不全的发病机制有关。与对照组相比，所有胎盘功能不全妊娠的胎儿脐带血中mtDNA拷贝数均升高，且线粒体基因，mt-TF/RNR1和线粒体编码细胞色素c氧化酶亚基1（mt-CO1）显示出非常低的甲基化水平;在最严重的病例中，D-loop区甲基化进一步降低，并与脐静脉氧分压（PO2）相关[45]。组织良好的线粒体功能和动力学对早期胚胎发育至关重要，大多数线粒体基因经历了从头甲基化，这可能会在早期发育过程中对线粒体功能和动力学产生影响[46]。一项关于胎儿甲状腺激素对胎盘mtDNA含量和线粒体DNA甲基化的作用的研究结果表明，脐带血血清游离三碘甲腺原氨酸（FT3）和血清游离四碘甲腺原氨酸（FT4）与胎盘mtDNA甲基化在线粒体基因MT-RNR1和D-loop区域成负相关，而与胎盘mtDNA含量成正相关[47]。研究人员在猪卵母细胞中证实从健康和多囊性卵母细胞（PCO）分离的卵母细胞的质量，与一碳代谢、线粒体DNA甲基化和线粒体功能相关。线粒体分布在PCO卵母细胞中被破坏，同时线粒体膜电位降低，线粒体结构变形。PCO卵母细胞中mtDNA拷贝数和mtDNA编码基因的表达显着降低。此外，编码12S和16S rRNA及ND4的mtDNA序列以及D-环区域在PCO卵母细胞中显着高甲基化。这些结果表明，一碳代谢的异常激活和mtDNA的高甲基化可能在很大程度上导致母猪线粒体功能障碍和多囊卵巢来源的卵母细胞质量下降[48-49]。

最近，一项心血管疾病研究中发现，血小板mtDNA存在甲基化，并且甲基化水平与心血管疾病相关，患有心血管疾病的患者血小板mtDNA甲基化水平显著高于健康个体，并且此种差异与年龄，体重指数（BMI）和种族无关，心血管疾病中的差异线粒体甲基化为疾病的诊断和治疗提供了新思路[50]。

2型糖尿病（T2DM）的特征在于线粒体功能紊乱和氧化应激，由于临床没有有效的T2DM治愈方法，因此早期诊断前驱糖尿病和预防疾病便尤为重要。研究人员发现在糖尿病早期，线粒体甲基化水平异常与胰岛素敏感性受损存在一定相关性[51]。同时对受试者BMI分析，发现受试者的BMI在从较低分级指示数Q1到Q2阶段时，线粒体甲基化急剧增加，但从Q2到Q3仅是略有增加，而在Q3到Q4则无显著差异。因此，线粒体表观遗传变化与糖尿病风险增加和早期前驱糖尿病的指标有关，可能作为具有临床意义的前驱糖尿病或糖尿病早期阶段的生物标志物[49]。在糖尿病性视网膜病变中，糖尿病中高葡萄糖环境会使mtDNA高甲基化，而mtDNA的高甲基化可能是导致线粒体功能失调以及加速毛细血管细胞凋亡的原因[52]。

5展望

mtDNA控制着线粒体的基本功能，其分子结构简单、拷贝量多、无组织特异性，广泛参与细胞内信号传导和细胞凋亡，以及氨基酸，脂质，固醇和核苷酸的代谢，在细胞能量代谢中起着重要作用[35]。DNA甲基化是参与基因调控的重要表观遗传机制，核基因组DNA甲基化的改变与许多复杂疾病有关。线粒体DNA甲基化也越来越多受到关注，mtDNA甲基化水平可能受到大量细胞内或细胞外因素的影响，多种疾病中mtDNA甲基化水平出现显著异常，尤其是在线粒体功能相关疾病中[53]。虽然mtDNA甲基化的机制以及疾病与mtDNA甲基化的关系等相关研究还不够深入，但mtDNA甲基化可以作为一种早期分子事件，一种有效的疾病预测及诊断的潜在生物标志物，随着研究的深入，必将对相关疾病的诊断和预防产生深远意义。

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