大鲵皮胶原蛋白制备工艺优化及其抗氧化活性研究

杨碧仙1,2,曹 宇2,3,范琴芳1,袁 敏1,李 灿

(1.贵阳学院食品与制药工程学院,贵州贵阳 550005;2.贵州省山地珍稀动物与经济昆虫重点实验室,贵州贵阳 550005;3.贵阳学院生物与环境工程学院,贵州贵阳 550005)

中国大鲵(Andriasdavidianus)为我国特有珍稀物种之一,广泛分布于长江、珠江及黄河的中上游支流的山溪河流中,尤以贵州、陕西、四川、湖南、湖北等省多山地区较为多见[1-2]。现代研究发现,大鲵肉及皮肤中含蛋白质、多种氨基酸、矿物质及微量元素、免疫及抗氧化酶、胶原蛋白等物质,具有较高的营养价值[3-4];中医认为大鲵性味甘平,有滋补强壮功效,药效学研究证实大鲵有抗氧化、抑菌等药理作用[5-7]。大鲵因生长期较长,皮肤厚实紧致,既具有治疗烧烫伤作用[8],又富含胶原蛋白,是优质的食药兼用胶原蛋白来源之一。胶原蛋白分子含有独特的“三螺旋”结构,具有良好的生物活性[9],广泛应用于功能食品[10-11]、化妆品[12]、医药和生物材料[13-14]等行业。

大鲵因肉质鲜美且具有滋补强壮作用,故被大量捕杀食用,加之人类活动范围扩大的影响,自上世纪50年代野生大鲵数量急剧下降,被列为国家二级保护动物。因此,人工养殖与野化驯养大鲵受到研究者的关注[15]。贵州作为野生大鲵的主产区,虽然在自然原生态下大鲵种群不容乐观[16],但在人工养殖方面取得了较好的成果,养殖大鲵可以作为商品供给[17],奠定了合理开发利用大鲵资源的基础。

随着人工养殖大鲵数量的增加,如何有效开发利用大鲵的科学和应用价值受到关注,其中对大鲵胶原蛋白成为研究热点之一。目前,提取动物胶原蛋白主要采用低温酸提[18]和超声辅助酶解[19-20]等方法。而以往对大鲵皮胶原蛋白提取方法的研究主要集中在酶解法,如李莉等[21]采用胃蛋白酶提取大鲵皮胶原蛋白,但得率(12.73%)偏低的问题。因胶原蛋白三螺旋结构在采用酸提法时更容易得以保持,且提取所得的胶原蛋白呈现弱酸性状态而稳定性较高。因此,为提高大鲵皮利用价值,本研究参照文献[21]选择操作简单、经济适宜的酸提法,确定提取大鲵胶原蛋白最佳提取条件,并进一步对其体外抗氧化活性开展研究。相关研究将有助于大鲵皮的开发利用,为今后相应的胶原蛋白产品研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大鲵皮 由贵州省山地珍稀动物与经济昆虫重点实验室提供;L-羟脯氨酸(批号111578-200201) 中国食品药品检定研究院;1,1,-二苯基-2-苦基肼1898-66-4 北京中生瑞泰科技有限公司;氯胺T、盐酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、氢氧化钠、无水乙酸钠、正丙醇、高氯酸、对二甲基氨基苯甲醛、水杨酸、30%过氧化氢、7水合硫酸亚铁等 均为国产分析纯。

FA124电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;手提式高速分散器S10 宁波新芝生物科技股份有限公司;Allegrax-30R高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司;SY2015JX136紫外分光光度计 济南海能仪器股份有限公司;722可见分光光度仪 上海欣茂仪器有限公司;HH-2数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;DW-40L508医用低温保存箱 青海海尔特种电器有限公司;DF-101S集热式磁力搅拌器 郑州长城科工有限公司;101-Z型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;FD1C-80真空冷冻干燥机 浙江临海市谭氏真空设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大鲵皮预处理 将大鲵皮上残余的肉、筋膜、脂肪等清除干净,剪成0.5 cm×0.5 cm小片,清洗后放入冰箱中-20 ℃冻藏备用[22]。

1.2.2 不同种类酸对浸提胶原蛋白的影响 称取1.2.1处理后的大鲵皮1.0 g,分别以1.0 mol/L 的盐酸、柠檬酸、甲酸和乙酸为浸提剂,料液比为1∶20 (g∶mL),用手提式高速分散器进行匀浆,匀浆后置于具塞试管在25 ℃条件下放置24 h,抽滤,离心10 min(转速10000 r/min),即得不同种类酸浸提胶原蛋白液。分别测定并计算胶原蛋白得率。

1.2.3 不同温度对胶原蛋白液提取的影响 由于蛋白超过38 ℃会变性,因此选择提取温度应在38 ℃以下[23]。设定温度分别为5、15、25、35 ℃,以1.2.2中选出的最适宜酸为浸提液,并按1.2.2相同的提取方法制备不同提取温度下胶原蛋白液。分别测定并计算胶原蛋白得率。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 盐酸浓度对胶原蛋白得率的影响 称取1.2.1处理之后的大鲵皮1.0 g,在料液比1∶20 (g/mL)、提取温度为35 ℃、提取时间24 h的条件下,分析不同质量浓度的盐酸(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L)对胶原蛋白得率的影响。

1.2.4.2 料液比对胶原蛋白得率的影响 称取1.2.1处理之后的大鲵皮1.0 g,在盐酸浓度为0.4 mol/L、提取温度为35 ℃、提取时间24 h的条件下,分析不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)对胶原蛋白得率的影响。

1.2.4.3 提取时间对胶原蛋白提取率的影响 称取1.2.1处理之后的大鲵皮1.0 g,在盐酸浓度为0.4 mol/L、提取温度为35 ℃、料液比1∶15的条件下,分析不同提取时间(12、24、36、48、60 h)对胶原蛋白得率的影响。

1.2.5 正交试验设计 结合单因素实验结果,在最适宜酸为浸提剂、最适宜提取温度条件下,考察浸提液的酸浓度、提取时间、料液比三个因素对胶原蛋白得率的影响,设计三因素三水平的正交试验方案L9(34)。试验因素及水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factor and levels table of orthogonal experiment

1.2.6 胶原蛋白得率的测定 参照文献[24]方法,精密移取质量浓度为0.0、1.6、3.2、4.8、6.4、8.0 μg/mL的L-羟脯氨酸对照液1.0 mL标准液于试管中,依次加入2.0 mL正丙醇以及0.5 mL氯氨T试剂,室温下放置25 min,加入显色剂对二甲氨基苯甲醛溶液0.5 mL放入80 ℃水浴加热10 min,冷却,在560 nm处测吸光度。空白对照用蒸馏水替代,操作同上。以L-羟脯氨酸对照液质量浓度Y为横坐标,吸光度X为纵坐标,进行标准曲线绘制,得到回归方程Y=0.0726X+0.0015,相关系数R2=0.9901。结果表明,L-羟脯氨酸在0～8.0 μg/mL的范围内,呈线性关系,并具有较好的重现性、稳定性和精密度。

L-羟脯氨酸含量M(%)=(C×V)/m×100

胶原蛋白得率(%)=(M×11.1)×100

式中,M为大鲵皮中L-羟脯氨酸含量(g/100 g);C为待测液中的L-羟脯氨酸浓度(mg/mL);V为待测液体积;m为大鲵皮干品质量,m=鲜大鲵皮质量×(1-鲜大鲵皮水分含量);11.1为L-羟脯氨酸转化为胶原蛋白的系数,其中参照文献[25]测得鲜大鲵皮中水分含量为71%。

1.2.7 抗氧化性实验 取工艺优化试验获得的大鲵皮胶原蛋白液,处理后进行抗氧化性实验。

1.2.7.1 大鲵皮胶原蛋白粉制备 参照文献[26]方法,取优化提取的胶原蛋白液,加入70%硫酸铵溶液盐析,离心,弃去上清液,沉淀,用去离子水清洗,冷冻干燥,即得大鲵皮胶原蛋白粉。

1.2.7.2 清除DPPH自由基的试验 参照文献[27-28]方法,将胶原蛋白粉配制成质量浓度为2、4、6、8、10 mg/mL溶液,移取2 mL样品液于具塞试管中,加入2 mL新配制的3×10-2mg/mL的DPPH溶液,振荡摇匀,在室温黑暗处静置30 min后,于515 nm处测定吸光度。同时测定不加样品溶液的DPPH溶液(阴性对照)的吸光度及不加DPPH溶液(空白对照)的吸光度。以胶原蛋白质量浓度为横坐标,DPPH自由基清除率为纵坐标绘制曲线。以不同浓度VC溶液(质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL)作为阳性对照组,采用同样测定方法,计算其DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

式中:A1:加入样品及DPPH溶液时的吸光度;A2:加样品及无水乙醇的吸光度(空白对照);A3:加入DPPH溶液及蒸馏水的吸光度(阴性对照)。

1.2.7.3 清除羟基自由基(·OH)的试验 参照文献[29-30],分别移取质量浓度为2.4、3.6、4.8、6.0、7.2和8.4 mg/mL的样品溶液1.0 mL于具塞试管中,分别加入2.0 mL 1.8×10-3mol/L的硫酸亚铁溶液,1.5 mL的1.8×10-3mol/L水杨酸-乙醇溶液,再加入0.8 mL 30%过氧化氢溶液,37 ℃水浴1 h,于520 nm波长处测定吸光度。空白组中用1.0 mL蒸馏水代替样品溶液;对照组中用蒸馏水代替过氧化氢溶液。以胶原蛋白质量浓度为横坐标,羟基自由基(·OH)清除率为纵坐标绘制曲线。以不同浓度VC溶液(质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL)作为阳性对照组,采用同样测定方法,计算其对羟基自由基(·OH)的清除率。

羟基自由基(·OH)清除率(%)=[A0-(A1/A1′)/A0]×100

式中:A0:以蒸馏水代替样品液的吸光度(空白组);A1:加入样品的吸光度;A1′:蒸馏水代替H2O2的吸光度(对照组)。

1.3 数据处理

数据采用Origin 9.1处理绘图,用SPSS 23.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 提取条件

2.1.1 不同种类酸浸提胶原蛋白液的效果 胶原肽链存在着许多碱性基团,与酸结合后,胶原分子间及肽链间的离子交联键和氢键将被打开,胶原就会发生酸溶,因此低浓度的酸溶液能使得鱼皮组织纤维膨胀溶解。而不同种类的酸对胶原分子内部结构的影响不同,最终使得不同的酸对胶原蛋白得率产生不同的影响[31]。由图1可知,在相同的质量浓度和提取条件下,盐酸对大鲵皮胶原蛋白的提取效果最优,其次是甲酸和乙酸,而柠檬酸的提取效果最弱。因此,在后续胶原蛋白的提取过程中选用盐酸为浸提剂。

图1 不同种类酸提取大鲵皮胶原蛋白得率的影响Fig.1 Effect of different types of acid extraction on the yield of collagen

2.1.2 不同温度下提取大鲵皮胶原蛋白效果 由图2可知,随着温度的增加,提取大鲵皮胶原蛋白的得率也随之提高,在35 ℃时,胶原蛋白的得率可达25.5%。张敏[23]报道,蛋白质在超过38 ℃后,会出现变性的趋势,因此,选择35 ℃为最佳提取温度。

图2 提取温度对大鲵皮胶原蛋白得率的影响Fig.2 Effect of different extraction temperature on the yield of collagen

2.2 单因素实验

2.2.1 盐酸浓度对大鲵皮胶原蛋白提取的影响 由图3可知,大鲵皮胶原蛋白得率呈现随盐酸浓度增加先上升,至盐酸浓度0.4 mol/L时,胶原蛋白提取得率达到最大值,此时大鲵皮中胶原蛋白浸提得率为29.4%,之后逐步下降,推测是在胶原蛋白的提取过程中pH过低会导致胶原的变性和破坏。因此,选择浓度0.4 mol/L的盐酸为浸提液。

图3 盐酸浓度对胶原蛋白得率的影响Fig.3 Effect of hydrochloric acid concentration on the extraction yield of collagen

2.2.2 料液比对大鲵皮胶原蛋白提取的影响 由图4可知,料液比达到1∶15 (g/mL)时,大鲵皮中胶原蛋白的提取效果较好,得率为27.1%,之后虽然溶剂量持续加大,但是当料液比超过一定限度时,可能因为搅拌子形成的剪切力变小[32],使得胶原蛋白得率出现下降趋势。因此,料液比选择为1∶15 (g/mL)。

图4 料液比对胶原蛋白得率的影响Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on the extraction yield of collagen

2.2.3 提取时间对大鲵皮胶原蛋白提取的影响 由图5可知,随着提取时间的增加,胶原蛋白得率先增加,在提取时间36 h时,大鲵皮中胶原蛋白得率较高,为23.3%,之后开始下降。因此,浸提时间选择为36 h。

图5 提取时间对胶原蛋白得率的影响Fig.5 Effect of extration time on the extraction yield of collagen

2.3 正交试验

由表2比较R值的大小可以看出,浸提液盐酸浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)三个因素中,对大鲵皮中胶原蛋白提取效果的影响程度由大到小为:A>B>C,即盐酸浓度的影响最大,其次是料液比,而提取时间的影响最小,可确定最佳提取条件为A2B2C1,即盐酸浓度为0.4 mol/L、料液比1∶15 (g/mL)、提取时间24 h。该条件为筛选所得的盐酸法提取大鲵皮胶原蛋白的最优条件。由表3方差分析可以看出,浸提液盐酸浓度对大鲵皮中胶原蛋白提取效果具有显著性影响(P<0.05),料液比和提取时间对大鲵皮中胶原蛋白提取效果无显著性影响(P>0.05)。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis

注:* 影响显著,P<0.05。

2.4 验证实验

根据优化得到的大鲵皮中胶原蛋白提取条件:盐酸浓度为0.4 mol/L、料液比1∶15 (g/mL)、提取时间24 h。在该条件下进行三次验证实验,得到胶原蛋白得率分别为39.8%、40.3%、40.5%,平均值为40.2%,RSD值(n=3)为0.90%。验证实验表明,优化获得的大鲵皮中胶原蛋白的提取条件A2B2C1是可信可行的。

2.5 抗氧化活性研究

2.5.1 大鲵皮中胶原蛋白对DPPH自由基清除能力 由图6 可知,大鲵皮中胶原蛋白质量浓度和VC清除DPPH自由基的能力表现出剂量相关性。其IC50分别为9.96 mg/mL和2.14 μg/mL,表明虽然弱于VC对照,但大鲵皮的胶原蛋白具有较好的清除DPPH自由基的能力。

图6 胶原蛋白清除DPPH自由基的能力Fig.6 Scavenging effects of collagen on DPPH free radical

2.5.2 大鲵皮中胶原蛋白对羟基自由基(·OH)清除能力 由图7可知,大鲵皮中胶原蛋白与VC对羟基自由基(·OH)清除能力均随样品质量浓度的增加而增大,且呈现出良好的剂量依赖效应,通过计算得到IC50值分别为7.79 mg/mL和1.75 μg/mL。当胶原蛋白质量浓度为8.4 mg/mL 时,其清除率为51.6%,且仍保持上升趋势,表明大鲵皮中胶原蛋白具有较强的羟基自由基清除能力。

图7 胶原蛋白清除·OH 的能力Fig.7 Scavenging effects of collagen on hydroxyl free radical

3 结论

影响大鲵皮中胶原蛋白提取效果的因素顺序为:盐酸浓度>料液比>提取时间,优化获得的最佳工艺条件为:以0.4 mol/L 的盐酸作为浸提剂,采用1∶15 (g∶mL)的料液比,提取时间为24 h。通过三次重复验证实验,表明在此优化工艺条件下,运用酸法浸提大鲵皮中胶原蛋白得率可达40.2%,高于文献报道[21]的酶法提取大鲵皮胶原蛋白得率,且与酶法比较所用提取时间无明显差异。体外抗氧化试验表明,酸法提取大鲵皮中胶原蛋白具有较好的清除DPPH自由基和羟基自由基(·OH)能力,IC50值分别为9.96和7.79 mg/mL。工艺优化实验和体外抗氧化性实验的综合结果表明,酸法提取大鲵皮中胶原蛋白不仅能获得较高的得率,且因酸法提取可较好地保持胶原蛋白的三螺旋结构,加之制备胶原蛋白粉采用硫酸铵盐析法而使终产品呈pH5.5～6.7的弱酸性状态,有利于保持胶原蛋白的稳定,因而能较好地保留其抗氧化活性,与目前文献[21]报道的相关研究比较,本研究对大鲵皮胶原蛋白提取有一定的指导价值,对合理利用和开发大鲵资源具有一定意义。