外周血单核细胞上Tim-3、PD-1在原因不明复发性流产及先兆流产中的表达特征及临床意义

梁 贤 迟学静 叶乔生

1.山东中医药大学附属医院(济南，250011)；2.解放军第960医院

复发性流产中有1/2为原因不明复发性流产(URSA)[1]。免疫学研究认为母-胎免疫耐受异常与复发性流产联系密切，T细胞活化在免疫反应中发挥着关键性作用，而T细胞活化需要通过共刺激分子来刺激，抑制信号来产生免疫活化或免疫抑制作用[2]。T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(Tim-3)和程序性死亡因子-1(PD-1)是近年来被发现的两种传递负性信号的共刺激分子。研究认为[3]Tim-3、PD-1除了参与自身免疫性疾病、慢性感染性疾病、肿瘤免疫逃逸、移植排斥反应等，还与母胎免疫耐受的维持与诱导相关。目前，临床关于Tim-3、PD-1与病理妊娠相关性研究主要集中在适应性免疫方面，而二者在先天免疫中的作用尚未完全明确。本研究探讨URSA及先兆流产患者外周血单核细胞上的Tim-3、PD-1表达特征，为临床治疗、干预URSA和先兆流产提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2015年5月-2019年5月在本院就诊或规律产前检查发生URSA(URSA组)、先兆流产早孕妇女(先兆流产组)和正常早孕妇女(正常组)各80例，均有停经史，尿妊娠试验或血绒毛膜促性腺激素(HCG)检测阳性，B超显示为早期宫内妊娠。URSA符合诊断标准[4]：连续自然流产次数≥3次，且经相关检查排除双方染色体异常、内分泌激素异常及支原体、衣原体、弓形虫、疱疹病毒感染等。先兆流产符合诊断标准：少量阴道出血，但无妊娠物排出。正常早孕妇女既往无自然流产、死产或死胎史，无内分泌紊乱、生殖道感染、自身免疫性疾病、染色体畸形病史，孕期无腹痛或阴道出血。本研究通过了本院医学伦理委员会批准，所有孕妇均自愿参与研究并签署了知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1仪器与试剂美国Beckman公司生产的CyAN-ADP流式细胞仪、台式高速冷冻离心机；美国Thermo公司生产的气套式三气培养箱、全波长扫描式多功能酶标仪；日本TOMY公司生产的全自动高压灭菌器；美国BioLegend公司生产的鼠抗人CD14-FITC，PE标记的抗小鼠Tim-3抗体、PD-1抗体试剂盒；美国R&D公司生产的人白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-12(IL-12)、干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫吸附试剂盒。

1.2.2标本采集与单核细胞分离采集孕妇外周静脉血肝素抗凝，静置后收集血浆-20℃保存。使用Ficoll密度梯度离心法分离标本获得单个核细胞，细胞计数板计数制备单细胞悬液(浓度1×106～2×106/ml)。

1.2.3 Tim-3、PD-1检测取100μl单细胞悬液，分别加入CD14、PD-1、Tim-3检测试剂，每管均设同型对照，26℃避光孵育15min，加入洗涤缓冲液洗涤，离心10min后弃上清液，再加入洗涤缓冲液使细胞重新混悬。使用流式细胞仪检测CD14+单核细胞上的Tim-3、PD-1表达。

1.2.4 IL-4、IL-12、IFN-γ检测冰冻血浆标本室温下解冻，离心，酶联免疫吸附法测定血浆IL-4、IL-12、IFN-γ水平，严格按照试剂盒说明进行操作，检测OD450nm值，根据OD值、标准品浓度绘制标准曲线，计算IL-4、IL-12、IFN-γ质量浓度。

1.3 观察指标

比较各组孕妇CD14+上的Tim-3、PD-1表达水平，外周血浆IL-4、IL-12、IFN-γ表达水平；分析IL-4、IL-12、IFN-γ表达与CD14+上Tim-3、PD-1水平的相关性。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 基线资料

3组孕妇基线资料比较无差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组孕妇的基线资料比较

2.2 各检测指标表达

3组孕妇外周血单核细胞上的Tim-3、PD-1水平，Tim-3、PD-1水平URSA组最低，先兆流产组次之，正常组最高(P<0.05)。3组孕妇外周血IL-4、IL-12、IFN-γ水平比较， IL-4水平URSA组最低，先兆流产组次之，正常组最高； IL-12和IFN-γ水平均URSA组最高，先兆流产组次之，正常组最低(P<0.05)。见表2。

表2 各组血各项检测指标比较

2.3 外周血各检测指标相关性分析

对URSA组、先兆流产组孕妇的血浆IL-12、IL-4、IFN-γ、Tim-3、PD-1水平进行相关分析。结果显示，IL-12与IL-4、Tim-3、PD-1水平均呈负相关，与IFN-γ呈正相关(P均<0.05)；IL-4与IFN-γ、Tim-3、PD-1均呈正相关；IFN-γ与Tim-3、PD-1均呈负相关；Tim-3与PD-1呈正相关(均P<0.05)。见表3。

表3 外周血浆各检测指标相关性分析(r)

3 讨论

流产是孕期常见并发症，流产早期仅有阴道少量出血，多数经治疗或休息后可持续妊娠，为先兆流产[5]。随着阴道出血量的增加，先兆流产也可发展为难免流产。自然流产的病因较多，宫腔粘连、子宫发育异常、子宫占位、染色体异常、内分泌异常、感染、免疫功能紊乱等均是流产的常见病因。有研究指出[6]，流产次数越多，流产复发率越高，临床将连续发生≥3次病因不明的自然流产定义为URSA。目前，临床对URSA和先兆流产的发病机制尚未完全明确，有学者指出先兆流产和URSA的发生可能与免疫功能失衡有关[7]。母体对胎儿同种异体移植物的免疫耐受是维持妊娠的基础，如果孕期母体对胎儿的免疫耐受程度降低，则会使得流产风险大大增加。负性调控因子在母-胎免疫平衡中发挥着关键性作用，Tim-3、PD-1均为T细胞负性调节分子，其可由适应性免疫细胞和先天免疫细胞共同表达，对T细胞反应发挥负性调节作用，多项研究均已证实Tim-3和PD-1在多种自身免疫性疾病中发挥着关键性作用[8]。国外有文献资料显示[9]，人体早期免疫反应中有Tim-3的参与，能对巨噬细胞活性发挥抑制作用。国内有研究指出[10]，相比正常人，丙型肝炎病毒感染者外周血中单核细胞上的Tim-3表达水平明显更高，单核细胞功能受到了明显抑制。另有研究发现[11]，体外阻断Tim-3基因表达后，单核细胞上的PD-1表达也相应地降低，而阻断PD-1基因表达后，单核细胞上的Tim-3表达也随之降低，提示PD-1与Tim-3可能具有协同作用。何泽现等[12]研究显示，相比未孕妇女，孕妇外周血单核细胞上的Tim-3表达和血浆中的IL-4表达明显更高，提示单核细胞上的Tim-3可能调节IL-4等Th2型细胞因子的产生。

本次研究显示，相比正常孕妇，URSA和先兆流产孕妇CD14+T细胞上的Tim-3、PD-1水平均更低，提示流产的发生可能与单核细胞上Tim-3、PD-1低表达有关。这是因为Tim-3、PD-1低表达会弱化其对Th1细胞的负调节作用，从而打破辅助性T细胞(Th)的平衡状态，引起Th1/Th2平衡紊乱，不利于胎儿生存，增加流产风险；另一方面，Tim-3、PD-1的低表达也会减弱其对Th17细胞分化和对调节性T细胞(Treg)促分化的抑制作用，从而引起Th17/Treg失衡，增加胚胎丢失风险。IL-12是由单核细胞分泌的促炎因子，能通过结合T细胞表面的IL-12受体发挥免疫活化作用，可诱导IFN-γ产生，促进Th1细胞因子分泌，是适应性免疫与先天性免疫的连接枢纽。国内相关研究显示[13]，URSA患者外周血中人脑胶质瘤组织中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达升高，机体处于强炎症反应状态。另有研究发现[14]，先兆流产患者外周血中的Th17/Treg平衡有向Th17漂移的趋势，促炎细胞占据优势地位。本次研究结果显示，孕妇外周血IL-12、IFN-γ水平在URSA、先兆流产、正常孕妇依次降低，表明相比正常孕妇，先兆流产和URSA孕妇体内的促炎因子较多，抑炎因子减少，体内炎症反应明显。林春明等[15]研究显示，URSA患者外周血中IFN-γ表达水平升高，而IL-4水平降低，Th1/Th2平衡向Th1漂移。本研究也显示URSA和先兆流产孕妇的外周血IL-4水平低于正常孕妇；相关分析发现，URSA和先兆流产孕妇外周血IL-12、IFN-γ与Tim-3、PD-1水平均呈负相关，提示Tim-3、PD-1可能通过调节单核细胞的IL-12、IFN-γ分泌能力来发挥体液免疫和细胞免疫调节功能，促使CD4+T细胞向Th2偏移，以保证成功妊娠。

综上所述，URSA及先兆流产的发生可能与外周血单核细胞上Tim-3、PD-1表达降低有关，临床可将其作为治疗URSA和先兆流产的潜在靶点，有望从免疫反应启动阶段采取干预措施，以实现URSA的有效防治。