人溶菌酶在毕赤酵母中的表达及体外抑菌活性研究

李学优 曹丁 肖宏艳 黄秀敏 甘祥武

摘要  对重组人溶菌酶真核表达载体的构建筛选、表达与活性鉴定，经过双酶切和测序鉴定表明，重组载体正确。电转化毕赤酵母GWDL菌株，通过G418抗性平板筛选得到高表达高效价菌株，经诱导表达，检测蛋白含量，体外抑菌检测，表达产物15 ku和预期结果一致，筛选得到效价为1 907 U/mL，编号为 SMD1168-pPIC9k-HLZ的高效价菌株;采用重组人溶菌酶制剂，检测样品GWDL对5种菌的最小抑菌浓度（MIC） ，藤黄微球菌的最小抑菌浓度较好，表明重组人溶菌酶在毕赤酵母中成功表达，活性较为稳定。

关键词  毕赤酵母;菌株筛选;高效表达;抑菌活性

中图分类号  S  188文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2020）04-0100-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.029

開放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Expression of Human Lysozyme in Pichia Pastoris and Its Antibarterial Activity in vitro

LI Xue-you，CAO Ding，XIAO Hong-yan et al  （Guangzhou lnstitute of Microbiology，Guangzhou，Guangdong 510663）

Abstract  The screening， expression and activity identification of constructed recombinant human lysozyme eukartic expression vectors were studied.The recombinant vectors were shown to be correct through double enzyme digestion and sequencing identification.To electro-transform the pichia pastoris GWDL strain， through G418 resistance flat screening to obtain high expression of high-efficiency strains，the expression product（15 ku） was consistent with the expected results after induced expression， detection of protein content and in vitro antiseptic detection，

we obtained No. SMD1168-pPIC9k-HLZ high titer strain with a titer of 1 907 U/mL;To detect the sample GWDL minimum bacterial concentration （MIC） for five bacteria by using Recombinant human lysozyme preparation，the minimum concentration of micrococcus luteus was better， indicating that recombinant human lysozyme in pichia pastoris successfully expressed，the activity was more stable.

Key words  Pichia pastoris;Strain screening;Efficient expression;Antibacterial activity

溶菌酶是小分子碱性蛋白，因其能有效地降解微生物的细胞壁，溶解作用较好，不易产生耐药性，无副作用等优点，被广泛应用于医药制剂、食品防腐等多个行业。溶菌酶可从胎盘中少量提取得到，因提取量较少，有着巨大的应用前景[1-3]。

毕赤酵母是一种真核表达菌株，此系统具有稳定性、高效表达、分泌性等特点，可通过甲醇诱导，提高溶氧量，使得菌株效价更高[4-5]。该研究以毕赤酵母为表达系统，重组质粒，经电击转化SMD1168，菌株经G418抗性筛选，对筛选菌株进行诱导表达，加大溶氧量提高表达量，检测活性，得到毕赤酵母的高效表达，以期为后期扩大培养打下基础。

1  材料与方法

1.1  材料与试剂

大肠杆菌DH5α、pPIC9K质粒、藤黄微球菌、毕赤酵母SMD1168由广东省微生物种质资源库保存。

PFU Mix、DNA 胶回收试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒、引物、核酸染色剂、琼脂糖购自生工生物工程（上海）股份有限公司;T4 DNA连接酶、限制性内切酶、G418、DNA Marker、Protein Marker购自TaKaRa公司;酵母抽提物、胰蛋白胨购自英国 Oxoid公司;cDNA合成试剂盒购自Toyobo公司;重组人溶菌酶标准品购自Sigma公司;琼脂粉购自广州环凯生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2  主要仪器设备

生化培养箱，DHZ-DA大容量全温振荡器，752N型紫外可见分光光度计，PCR仪，恒温金属浴，水平/垂直电泳仪，蓝光切胶仪，显微镜，电子天平，pH计等。

1.3  引物设计与合成

根据GenBank上发表的人溶菌酶基因成熟肽序列及表达载体pPIC9k多克隆位点，用DNA star 5.0设计合成引物C1、引物C2，其中引物C1含有Xho I 酶切位点（下划线部分），引物C2含有Not I 酶切位点（下划线部分），插入序列带有蛋白酶裂解位点，表达的溶菌酶有天然的N端。

引物C1：CCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAGGTCTTTG;引物C2：CTGCGGCCGCTTACACTCCACAACCTTGAACATA。

1.4  人外周血淋巴细胞总RNA的提取及cDNA模板的克隆

收集无菌血样，取 5  mL（适量肝素抗凝）。将采得的抗凝血在无菌状态下缓慢加入 2倍 Ficoll淋巴细胞分离液， 2 000 r/min离心10 min，取云雾状的单核细胞层;用Trizol法按照试剂盒说明提取人外周血淋巴细胞总RNA，即得到人淋巴细胞总RNA;并以总RNA为模板，用cDNA第一链合成试剂盒进行cDNA合成反应。

1.5  人溶菌酶基因序列的PCR扩增

以反转录的cDNA为模板，取引物C1、C2（10 μmol/L）各2 μL，PFU Mix  25 μL，补充双蒸水至50 μL， PCR反应程序：94 ℃ 3 min;94 ℃30 s，58 ℃30 s ，72 ℃40 s，30个循环;72 ℃ 10 min。反应结束后将反应產物分别于1%琼脂糖凝胶中电泳，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收，回收产物即为人溶菌酶成熟肽基因片段。

1.6  人溶菌酶真核表达载体的构建与鉴定

将人溶菌酶基因片段和pPIC9k质粒分别用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切反应后，回收酶切产物并进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ，构建表达载体pPIC9k-HLZ。将转化菌落经菌落PCR鉴定，提取阳性克隆质粒送上海生工进行序列测定。

1.7  重组质粒对毕赤酵母SMD1168的转化及筛选

将构建的重组质粒pPIC9k-HLZ，根据《毕赤酵母表达手册》用Sac Ⅰ进行单酶切，线性化质粒电击转化SMD1168，转化后的酵母细胞在无组氨酸培养基中培养至长出单菌落。挑选转化平板上长出来的菌落，用裂解液进行PCR模板制备，利用通用引物α-Factor和3AOX进行PCR扩增，将筛选到的阳性转化子经浓度逐渐增高的G418抗生素筛选高拷贝克隆，用于表达目的蛋白。取证实整合有人溶菌酶目的基因的菌落，为提高目的基因拷贝数，提取质粒进行二次转化，最后将转化菌液涂布于含1 mg/mL G418的YPD平板上，做高抗筛选，依次增加G418抗性平板浓度，筛选高拷贝克隆菌株，筛选菌株标记为SMD1168-pPIC9k-HLZ。

1.8  人溶菌酶的诱导表达及检测

将菌株SMD1168-pPIC9k-HLZ每组抗生素浓度分别选择3株接种到BMGY培养基中，培养24 h后按照10%接种量转接BMMY表达培养基中用甲醇进行诱导表达，于培养的24、48、72 h取表达上清进行SDS-PAGE蛋白电泳和抑菌活性检测。

1.9  重组酵母表达人溶菌酶抑菌活性测定

1.9.1  重组人溶菌酶抑菌效价测定。将培养好的藤黄微球菌菌液调整至合适的菌浓，加适量入熔化后的固体检测培养基中，吸取混合均匀的含菌检测培养基20 mL，使其在90 mm培养皿底内均匀摊布，放置在超净工作台上待其凝固。然后用灭菌的打孔器（孔径4.2 mm）在每个培养皿均匀地打孔，每孔加入20 μL重组毕赤酵母表达上清，置于37 ℃培养箱中培养40～48 h。

标准曲线制作：将稀释好的2万、1.5万、1万、5 000、2 500、1 000标准品点样于同一个平板上。分别以标准品溶菌圈直径的平方为横坐标，活性单位的常用对数值为纵坐标，制作标准曲线。取待测样品稀释，使其活性单位在标准曲线的活性浓度范围内，将样品的抑菌圈直径数值代入标准曲线，计算样品抑菌效价（U/mL）。

1.9.2  重组人溶菌酶制剂对体外常见致病菌的最小抑菌浓度测定。

调整每管致病菌菌液浓度约为1×106 CFU/mL，使用常量稀释法，将重组人溶菌酶制剂稀释成浓度分别为50.200、25.100、12.550、6.275、3.138、1.569、0.784、0.392、0.196、0.098 mg/mL，检测重组人溶菌酶制剂对藤黄微球菌、大肠标准菌株、大肠杆菌K12D31、巨大芽孢杆菌、沙门氏菌5种菌株抗菌药物最低抑菌浓度。

2  结果与分析

2.1  人溶菌酶基因序列的PCR扩增

由图1可知，反转录后克隆人溶菌酶成熟肽基因序列，经琼脂糖凝胶电泳检测，发现有一条清晰的条带，PCR扩增后的溶菌酶成熟肽基因序列，经琼脂糖凝胶电泳检测，发现有一条清晰的条带，与DNA Marker相比，大小位于500 bp左右，带酶切位点的人溶菌酶基因序列为429 bp，条带大小相符。

2.2  人溶菌酶真核表达载体的构建与鉴定

从图2可看出，选取人溶菌酶基因和pPIC9k连接产物转化子，经菌落PCR扩增，有明显条带，与DNA Marker比对，位于500 bp附近。由于鉴定PCR中采用的是α-Factor和3AOX引物，因此扩增出来的片段是583 bp，与PCR检测的结果基本相符。将鉴定为阳性克隆的重组子委托上海生工进行序列测定，测序结果显示，此基因序列与GenBank上提供的相关基因序列的同源性为100%。将此步构建的重组质粒含重组人溶菌酶基因命名为pPIC9k-HLZ。

2.3  重组质粒对毕赤酵母SMD1168的转化及筛选

用载体的通用引物α-Factor和3AOX进行PCR分析，得到约583 bp的片段，阴性对照无扩增片段，表明人溶菌酶基因表达单元已成功重组到酵母染色体上，获得了人溶菌酶重组菌株，表型均为His+Mut+（图3）。获得的这些菌株可以作为甲醇诱导表达的菌株。

2.4  表达蛋白的电泳检测

分别取重组酵母24、48、72 h的摇瓶诱导表达上清做电泳鉴定，同时以空酵母菌SMD1168的诱导上清和空载体pPIC9k转化酵母菌的诱导上清作为对照，进行15%SDS-PAGE分析。

将筛选到的高拷贝阳性毕赤酵母重组子SMD1168-pPIC9k-HLZ进行摇瓶诱导表达试验，分别取不同时间表达上清进行15%SDS-PAGE电泳。从图4可以看出，在15 ku左右出现特异蛋白条带，与预期分子量16 ku大小基本相符，而阴性对照未重组的SMD1168和空质粒转化对照SMD1168-pPIC9k未出现相应条带。光密度扫描结果显示，重组人溶菌酶基因重组酵母摇瓶蛋白表达量在48 h达到最高，72 h保持稳定，可选择48 h为结束培养时间。

2.5  抑菌活性检测

从图5可看出，溶菌酶的抑菌活性与菌株的抗生素抗性在一定范围内呈正相关，拷贝数的增加并不能持续提高溶菌酶的表达，可能跟宿主菌细胞的物质代谢有关。选取抗3.0 mg/mL的重组毕赤酵母分泌表达菌株SMD1168-pPIC9k-HLZ进行后续的优化试验。

2.6  重组人溶菌酶制剂对体外常见致病菌的最小抑菌浓度测定

取抑菌效价为12 000 U/g左右的重组人溶菌酶制剂，测定其对不同致病菌株的MIC。从表1可看出，其对革兰氏阳性菌有较好的抑菌作用，对革兰氏阴性菌抑菌作用较差，对藤黄微球菌的最低抑菌浓度最小，抑菌效果最好，对沙门氏菌无抑菌作用，此抑菌数据对重组人溶菌酶制剂后期在饲料添加剂领域的应用具有指导作用。

3  结论与讨论

该研究成功构建载体，整合重组人溶菌酶，通过转化筛选，经诱导表达，检测蛋白含量，进行体外抑菌检测，表達产物15 ku，和预期结果一致，筛选得到效价为1 907 U/mL，编号为 SMD1168-pPIC9k-HLZ的高效价菌株;重组人溶菌酶制剂，通过检测样品毕赤酵母GWDL对5种菌的最小抑菌浓度（MIC），对藤黄微球菌的最低抑菌浓度最小，抑菌效果最好，对阳性菌有较好的抑菌作用。

毕赤酵母分泌表达人溶菌酶基因的研究较多，其成分简单，便于制成溶菌酶基因工程产品，而关于胞外表达的研究较少，关于溶菌酶的研究很多[6-7]。目前，国内外人溶菌酶主要是基因工程表达，表达产物大多都是包涵体的形式，为保证蛋白分离纯化和重组蛋白的活性 ，毕赤酵母表达系统产物都分泌于培养上清中，自身所分泌的蛋白较少，比较有利于蛋白分离纯化[8] 。但市面上由于致病菌的耐药性问题日益加剧，抗生素的滥用，导致安全性问题越来越严重。人溶菌酶是人体自身产生的碱性肽类抗菌物质，其解决了抗生素滥用引起的耐药性和药物残留问题[9-10]。将溶菌酶添加到饲料中，会大大减低畜禽的发病率，可提高动物的生产性能。试验重组人溶菌酶，提高菌株活性，在后期大量生产得到高效能产物，减少生产成本。

参考文献

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