复方降脂颗粒对2型糖尿病大鼠的降血糖作用及其作用机制的研究

王洪霞 王贤娴

迄今为止世界范围内糖尿病患者已经超过3.5亿，其中我国糖尿病的发生率为9.7%，占全球糖尿病患者的30%[1]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是糖尿病中最为常见的一种类型，是由胰岛素分泌量相对不足或敏感度降低引起的内分泌代谢疾病。糖尿病患者常伴随着高血脂症，高血糖合并高血脂可明显加速大、中动脉血管粥样硬化的进展，严重危害患者的健康[2]。临床上对糖尿病合并高血脂症的药物治疗多采用化学合成的西药，虽然短期内效果显著，但同时会有一定的毒性不良反应[3～6]。因此，寻找一种能有效降糖和降脂且不良反应小的药物对于糖尿病合并高血脂症的治疗具有重要意义。

前期研究表明复方降脂颗粒能降低血脂水平，但其是否具有降糖作用尚未见研究。本研究通过建立T2DM大鼠模型，观察复方降脂颗粒对造模大鼠血糖、胰岛素的影响，分析其对胰岛和胰岛细胞的保护作用，最后检测各组大鼠胰腺组织中PI3K、PDK-1、pAKT 蛋白的表达，以探讨复方降脂颗粒对T2DM的降糖作用及其作用机制，为临床治疗糖尿病合并高血脂症提供参考。

材料与方法

1.材料:(1)试剂：复方降脂颗粒由新疆医科大学附属中医医院制剂室生产(新药制字Z20030013)。链脲佐霉素(STZ)购自美国Sigma公司。高糖高脂饲料购自北京鸿润宝顺科技有限公司。兔抗大鼠GAPDH、PI3K、PDK-1以及pAKT单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗体购自武汉谷歌生物科技有限公司。BCA定量试剂盒，葡萄糖氧化酶试剂盒和胰岛素放射免疫试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司。目的基因引物由金斯瑞生物技术有限公司合成。反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司。(2)实验动物：SPF级雄性SD大鼠40只，体质量130±10g，由新疆医科大学动物实验中心提供，实验动物生产合格证号：65000700000045。动物饲养环境SPF级，动物房12h/12h昼夜规律，分笼饲养，可自由摄食水，饲养温度为22±2℃。

2.分组与造模：大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组10只，造模组30只，分别给予普通饲料和高糖高脂饲料(猪油∶蔗糖∶奶粉∶鸡蛋∶常规饲料=10∶20∶4∶3∶64)喂养6周后，均禁食不禁水12h，造模组腹腔注射35mg/kg STZ(用0.1mol/L的无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解，调节pH值至4.4，现配现用)两周后，尾静脉采血，血糖仪检测空腹血糖≥7.8 mmol/L为T2DM大鼠造模成功。造模成功率为90%，有27只大鼠造模成功，随机选取20只用来进行干预实验。

3.干预方法：随机将造模成功的20只大鼠分成两组，分别是模型组和复方降脂颗粒组，每组10只，以未造模并以普通饲料喂养的10只大鼠为正常对照组。复方降脂颗粒组以灌胃的方法给予600mg/kg复方降脂颗粒[临床上患者每次服用1袋(8g),每天3次]，正常组和模型组分别给予等量0.9%NaCl注射液，每天1次，持续给药8周。药物干预期间用普通饲料喂养大鼠。

4.复方降脂颗粒对糖尿病大鼠血清中血糖、胰岛素水平的影响：干预周期完成后，所有动物禁食不禁水12h, 尾静脉末梢采血0.2ml, 5000r/min离心10min后取上清，-20℃冻存备用。分别采用葡萄糖氧化酶试剂盒和胰岛素放射免疫试剂盒检测各组大鼠空腹血糖水平(FBG)以及空腹胰岛素水平(FINS)。胰岛素敏感指数(ISI)=In[1/(FBG/FINS)]。

5.复方降脂颗粒对糖尿病大鼠胰腺组织病理学的影响：取血后大鼠处死，在无菌条件下解剖并快速取出胰腺，各组分别称取100mg用于检测组织中蛋白表达。剩余的组织用10%甲醛溶液固定，进行包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色、封片处理。光学显微镜下采集胰腺组织胰岛区域的图片，分析组织病理学改变。

6.qRT-PCR检测PI3K、PDK-1、pAKT的表达：用Trizol一步法提取胰腺组织中总RNA，紫外分光光度计测定其A260/A280的比值为1.8～2.0可认为纯度合格，用反转录试剂盒将其反转录成cDNA，通过qRT-PCR对各组胰腺组织中mRNA相对表达量进行比较和分析。引物序列如表1所示，PCR的参数设置为：95℃预变性4min后，以95℃运行20s，60℃退火并延伸30s的方法循环35周期扩增，至少重复3次。实验结束后收集荧光信号，记录每个反应管中荧光信号达到阈值时经历的循环次数用Ct值表示，以内参β-actin为对照，用2-△CT计算相对含量。

表1 用于RT-PCR检测的基因引物序列

7.胰腺组织中PI3K、PDK-1、pAKT蛋白表达水平的检测：取各组大鼠100mg的胰腺组织，加入RIPA细胞裂解液，低温匀浆裂解后提取组织总蛋白。BCA定量试剂盒定量各组织样本的总蛋白浓度，用Loading buffer调节各样本浓度使其一致。配置12%的SDS-PAGE胶，各样本上样50μg，以高分子marker鉴别条带位置。Bio-Rad电泳仪恒压70V跑120min后，取出胶块，放置到转膜槽中，300mA恒流跑100min从而将蛋白条带转移到PVDF膜上。用5% BSA孵育PVDF膜2h来封闭非特异性位点，TBST洗膜，重复3次，每次15min。加入PI3K、PDK-1以及pAKT的单克隆抗体，4℃条件下孵育过夜，TBST洗膜，重复3次。加入HRP-IgG二抗，室温下孵育2h，TBST洗膜，重复3次。将PVDF膜转移至凝胶成像仪中，滴加显影液后曝光并采集图片，用Image J图像分析软件对蛋白条带灰度值进行定量分析。

结 果

1.复方降脂颗粒对糖尿病大鼠血清中血糖、胰岛素水平的影响：检测各组大鼠血清中FBG、FINS水平，并计算ISI值。结果显示，与正常组比较，模型组大鼠的血清FBG、FINS水平显著升高，ISI值显著降低(P<0.05)。与模型组比较，复方降脂颗粒组大鼠的血清FBG、FINS水平显著降低(P<0.05)，同时ISI值显著升高(P<0.05)，详见表2。

表2 各组大鼠FBG、FINS、ISI的水平检测结果

与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；胰岛素敏感指数(ISI)=In[1/(FBG/FINS)]

2.复方降脂颗粒对糖尿病大鼠胰腺组织病理学的影响：HE结果显色，正常组的胰腺组织结构完整且形态规则，胰岛细胞紧密且大小均一，胞质丰富无空泡化；模型组的胰腺组织损伤严重，胰岛和胰腺细胞均出现退行性萎缩，仅有少数水肿变性的胰岛细胞稀疏分布，细胞间隙出现大量出血点；与模型组比较，复方降脂颗粒组的胰腺组织损伤程度明显减轻，胰岛细胞数目增多伴随水肿变形程度改善，细胞间隙偶有炎性细胞浸润现象,详见图1。

图1 复方降脂颗粒对糖尿病大鼠胰腺组织病理学的影响(HE，×200)A.正常组；B.模型组；C.复方降脂颗粒组

3.胰腺组织中PI3K、PDK-1、pAKT mRNA水平的检测: 模型组PI3K、PDK-1和pAKT mRNA表达水平显著低于正常组(P<0.05)。复方降脂颗粒组PI3K、PDK-1和pAKT mRNA水平显著高于模型组(P<0.05)，详见图2。

4.胰腺组织中PI3K、PDK-1、pAKT蛋白表达水平的检测: 与正常组比较，模型组胰腺组织中的PI3K、PDK-1和pAKT的表达水平显著降低(P<0.05)。复方降脂颗粒组中PI3K、PDK-1和pAKT的蛋白表达显著高于模型组(P<0.05)，详见图3。

图2 各组大鼠胰腺中PI3K、PDK-1、pAKT mRNA水平与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

图3 各组大鼠胰腺中PI3K、PDK-1、pAKT蛋白的表达情况A.蛋白免疫印迹；B.蛋白相对表达结果；与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

讨 论

糖尿病是目前危害人类健康的第3大慢性疾病，其发生率呈持续上升趋势，目前尚无根治的方法[8，9]。糖尿病患者并发血脂异常的比例较高，糖尿病合并高血脂症会进一步增加大血管和微血管并发症的风险[10]。目前治疗糖尿病合并高血脂症的药物虽然短期内效果显著，但是易耐药且会引发多种不良反应，使其临床应用受到限制[11]。因此，寻找高效且不良反应小的临床治疗药物意义重大。前期研究证实复方降脂颗粒具有利湿降浊、化瘀消积等功效，在临床上多用于治疗高脂血症，能有效降低患者的血脂水平[12]。但目前关于其在糖尿病治疗方面的研究报道尚无，本实验主要研究复方降脂颗粒对糖尿病模型大鼠血糖、胰岛素水平以及胰岛细胞形态的影响，并初步探究其降糖机制。

通过检测正常组、模型组以及复方降脂颗粒组的FBG、FINS的水平，计算ISI指数来评价复方降脂颗粒的降糖和改善胰岛素抵抗的作用。与模型组比较，复方降脂颗粒组有效降低T2DM大鼠的血糖和胰岛素水平。同时通过计算ISI可知，复方降脂颗粒组的T2DM大鼠的胰岛素抵抗情况得到显著改善。说明复方降脂颗粒能发挥降糖和改善胰岛素抵抗作用。本研究进一步探究了复方降脂颗粒对胰腺组织病理学的影响，HE染色发现，复方降脂颗粒组的胰腺组织受损程度得到明显减轻，胰岛细胞的数目增多的同时，细胞水肿变形程度也得到明显改善，说明复方降脂颗粒能对T2DM大鼠的胰腺起保护作用。以上结果说明，复方降脂颗粒在降低T2DM大鼠的血糖和胰岛素水平的同时，能有效地保护大鼠的胰岛和胰岛细胞，但其作用机制尚未明确，所以本研究就复方降脂颗粒的成分探讨了其可能的作用机制。

改善胰岛素信号转导是治疗T2DM的一个重要途径，其中PI3K/AKT信号通路是胰岛素下游的重要信号通路，与糖尿病的发展密切相关[13]。PI3K在细胞外生长因子的作用下激活，产生二磷酸磷脂酰肌醇和三磷酸磷脂酰肌醇，AKT在二磷酸磷脂酰肌醇的作用下产生同源二聚体并部分激活，进而在三磷酸磷脂酰肌醇以及磷酸肌醇脂依赖性蛋白激酶(PDK)的作用下锚定在细胞膜上，活化的AKT实现磷酸化并激活下游一系列信号通路，从而影响胰岛素对机体的降血糖功能，发挥保护胰岛细胞和调节胰岛素分泌的作用[14，15]。复方降脂颗粒由泽泻、五谷虫、蒲黄、三七、黄芪、淫羊藿等组成。复方降糖脂颗粒能够有效降低T2DM大鼠中的血糖含量可能是因为其含有泽泻、三七等成分。有研究报道，三七皂苷以及泽泻提取物均能上调pAKT的表达，从而促进下游的葡糖糖摄取和转运[16，17]。本研究先后采用qRT-PCR和Western blot法检测胰腺组织中PI3K、PDK-1以及pAKT的表达，来初步探究复方降脂颗粒发挥降糖作用的相关机制。检测结果发现，与正常对照组比较，模型组PI3K、PDK-1和pAKT mRNA和蛋白表达明显下调，复方降脂颗粒组呈显著上升趋势，说明复方降脂颗粒的作用机制与PI3K/AKT信号通路的激活有关，但是否是其中的三七、泽泻抑或是其他成分起作用还需后面的实验进一步证实。

综上所述，复方降脂颗粒能有效地降低T2DM大鼠的血糖和胰岛素含量，改善胰岛素抵抗情况，其机制可能与PI3K/AKT信号通路的激活有关，是临床治疗糖尿病合并高脂血症的重要候选药物。