吲哚美辛对骨肉瘤143B细胞增殖、迁移和凋亡的影响

郭良煜 陶春杰 陈敬腾 龚长天 施玉博 郭卫春

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是最常见的原发性骨肿瘤，好发于儿童和青少年，主要发生于长骨远端并且容易产生远处转移和侵袭。目前针对骨肉瘤治疗的金标准是新辅助化疗加手术切除，这使得骨肉瘤的5年生存率从20%提高到了60%[1]。然而，化疗药物的毒性和骨肉瘤细胞对化疗药物表现出的耐药性对骨肉瘤的临床治疗和长期存活率构成了极大挑战。近几年的研究表明诱导靶细胞凋亡是消灭癌细胞的关键因素[2～4]。

吲哚美辛是NSAID一类的抗炎药物，主要用于类风湿关节炎或骨关节炎等相关疼痛的对症治疗[5]。近年来已有相关文献报道吲哚美辛可以抑制结直肠癌细胞的增殖、分化和转移[6,7]同时也可以抑制结直肠癌细胞的增殖并诱导其凋亡[8～11]。然而，吲哚美辛对人类OS的作用仍有待于进一步研究。本研究通过细胞实验研究吲哚美辛对骨肉瘤143B细胞增殖、迁移、细胞形态和凋亡的影响，并初步探讨吲哚美辛抗骨肉瘤作用的相关分子机制，以期为吲哚美辛应用于临床骨肉瘤患者的治疗提供实验基础和理论依据。

材料与方法

1.材料:人骨肉瘤143B细胞购自中国典型培养物保藏中心(China Center For Type Culture Collection, CCTCC)；MEM培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司；1%双抗(青霉素100U/ml, 链霉素100μg/ml)购自吉诺公司;含EDTA的胰酶购自武汉谷歌生物科技有限公司；吲哚美辛、DMSO以及胰蛋白酶均购自美国Sigma 公司；Cell Counting Kit-8 (CCK-8)购自日本同仁化学研究所；Annexin V-FITC/PI(Propidium Iodide)细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；一抗 caspase-3、caspase-9、GAPDH、Bcl-2以及Bax均购自美国CST公司；HRP标记抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

2.细胞培养：人骨肉瘤143B细胞用含10%的胎牛血清和1%双抗的MEM培养基，于37℃、5%CO2的培养箱中常规培养, 取对数生长期的细胞进行后续实验。

3.细胞增殖能力检测：将骨肉瘤143B细胞以1×105个/毫升浓度接种于96孔板上。每孔加入100μl,过夜孵育待细胞贴壁后加入不同浓度的吲哚美辛，阴性对照组加入等体积的MEM培养基。分别培养24、48、72h后每孔加入10μl的CCK-8试剂，继续孵育2h后用酶标仪(澳大利亚Tecan Sunrise公司)测量450nm波长下的吸光度(A)值。A值与细胞活力和数量呈正比，所有试验均进行3次。

4.形态学观察：将骨肉瘤143B细胞以1×105个/毫升浓度接种于6孔板中。24h后分别加入不同浓度的吲哚美辛(0、400、600、800μmol/L)随后置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后, 在倒置显微镜下观察细胞贴壁情况和生长情况，并拍照。

5.细胞凋亡检测：将骨肉瘤143B细胞以1×105个/毫升浓度接种于6孔板中。用不同浓度的吲哚美辛(0、600、800μmol/L)处理骨肉瘤143B细胞24h后，用胰酶消化细胞，离心5min后用预冷的PBS洗涤细胞1次后用 250μl binding buffer重悬细胞，取100μl细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl的Annexin V/FITC和5μl的PI，混匀后避光孵育30min，最后再加入400μl binding buffer，随即用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

6.Transwell迁移实验:将小室放入24孔板中，随后将骨肉瘤143B细胞以每孔1×105个接种于小室的上室中。下室加入含20%血清的MEM培养基以建立血清浓度差。后用不同浓度的吲哚美辛(0、600、800μmol/L)处理骨肉瘤143B细胞。处理24h后用PBS清洗15min，用甲醇固定15min，吉姆萨染色10min。随后用棉签擦去上室的细胞，用倒置显微镜进行细胞计数。

7.Western blot法：将骨肉瘤143B细胞以每孔1×105个接种于6孔板中。用吲哚美辛(800μmol/L)处理骨肉瘤143B细胞24h后用PBS洗涤2次，随后加入RIPA裂解液提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度后用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转膜后用 5%的脱脂奶粉于室温封闭1h，后加入相应一抗随后在4℃条件下过夜孵育。后用HRP标记抗兔IgG于室温孵育2h。TBST溶液洗 5×10min，随后用ECL发光液显色后分析结果以目的蛋白与GAPDH的灰度比值表示蛋白表达水平。

结 果

1.吲哚美辛抑制骨肉瘤143B细胞增殖的影响:用不同的浓度分别处理143B细胞24和48h后用CCK8检测增殖能力(图1)。随着吲哚美辛浓度的增加，细胞活力在不断下降。同时相同浓度下的48h细胞活力均小于24h细胞活力，证明吲哚美辛可以抑制143B细胞的增殖，并且具有时间-剂量依赖性。

图1 吲哚美辛对骨肉瘤143B细胞增殖的影响与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01

2.吲哚美辛对骨肉瘤143B细胞形态的影响:用不同浓度的吲哚美辛处理骨肉瘤143B细胞24h后，用倒置显微镜观察细胞形态显示对照组细胞均贴壁同时生长良好，形态正常，排列规则且细胞密度高；而实验组中，细胞形态异常同时细胞皱缩且排列紊乱，并且随着吲哚美辛浓度的增加，细胞数量及密度明显减少(图2)。

图2 吲哚美辛对骨肉瘤143B细胞形态的影响(×100)A.对照组;B.400μmol/L吲哚美辛处理组;C.600μmol/L吲哚美辛处理组;D.800μmol/L吲哚美辛处理组

3.吲哚美辛对骨肉瘤143B细胞凋亡的影响:用不同浓度的吲哚美辛处理143B细胞后，用流式细胞仪检测细胞总凋亡率详见图3。总凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。随着吲哚美辛浓度的提高，实验组细胞的凋亡率不断增高。

4.吲哚美辛对骨肉瘤143B细胞迁移的影响:用不同浓度的吲哚美辛处理143B细胞后，倒置显微镜下观察细胞后发现，实验组细胞总数小于对照组细胞总数(图4)，并且随着吲哚美辛浓度的提高，实验组的细胞总数不断减少。

图3 吲哚美辛对骨肉瘤143B细胞凋亡的影响与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01

图4 吲哚美辛对骨肉瘤143B细胞迁移的影响(结晶紫，×100)与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01

5.吲哚美辛对凋亡蛋白的影响:为了探讨吲哚美辛诱导143B细胞的凋亡机制，检测143B处理后的Bcl-2的表达情况(图5)，与对照组比较，Bcl-2表达下调，证明吲哚美辛通过下调Bcl-2凋亡蛋白来诱导143B细胞的凋亡。

图5 吲哚美辛对凋亡蛋白的影响与对照组比较,*P<0.05

讨 论

骨肉瘤是骨科中常见的原发性骨肿瘤，具有容易复发和侵袭性强的特点。而传统的化疗因其毒性不良反应并且骨肉瘤容易产生耐药性的原理使得骨肉瘤的临床治疗效果无明显提高。而之前的研究中显示抗炎药物，例如赛来西布，可以抑制肿瘤细胞和血管生成、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤的侵袭和转移等[12，13]。同时吲哚美辛对胃癌、乳腺癌等恶性肿瘤有显著作用[14]。有研究证实了吲哚美辛可以抑制胃癌细胞的增殖和分化，同时通过调控细胞中的溶酶体从而导致细胞凋亡，并且吲哚美辛也可以抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭，并且与基于葡聚糖的化合物相混合后可以降低乳腺癌细胞的耐药性，其原理是减少了MDR相关蛋白所介导的化疗药物的排出[15，16]。

本研究通过不同浓度的吲哚美辛处理骨肉瘤143B细胞，结果显示吲哚美辛可以抑制骨肉瘤143B细胞的增殖和侵袭，诱导细胞的凋亡，而无论是细胞增殖还是侵袭，都与凋亡是密不可分的。凋亡的经典途径有两种：线粒体途径和Fas配体途径，两者都具有共同的下游通路caspase家族[17]。对于线粒体途径，在接受死亡信号转导后，Bcl -2影响电压依赖性阴离子通道 (VDAC)从而导致细胞膜电位降低，通透性增加，诱导细胞凋亡[18～20]。Western blot法检测结果显示Bcl-2表达下调，证实了吲哚美辛通过下调Bcl-2来诱导骨肉瘤143B细胞凋亡。

综上所述，吲哚美辛可以通过剂量依赖性和时间依赖性来抑制其骨肉瘤的增殖和迁移，同时通过下调Bcl-2来诱导骨肉瘤143B细胞凋亡。这为吲哚美辛治疗骨肉瘤患者提供了实验依据。但与骨肉瘤发生、发展有关的其他通路，例如Notch和Wnt通路等都未进行研究，后续实验将会研究吲哚美辛与以上两通路之间的联系。