舒脑欣滴丸中阿魏酸的药代动力学研究

石丹丹 邵诗佳 宋 奇 于新祥 高召军 李 珂 齐永秀

山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271016

舒脑欣滴丸是由川芎、当归两种药配伍[1]，以川芎为君药，辅以当归为臣，研制成舒脑欣滴丸，进一步增强了川芎活血散淤，通络止痛之力，同时兼顾养血柔络[2]。舒脑欣滴丸具有较好的药理作用，以缓络脉之拘急，通补兼施，通调并举，以达清脑、养脑护脑的作用。临床主要用于血虚血瘀引起的偏头痛，健忘、失眠等。研究表明舒脑欣滴丸对大鼠脑血流量有一定的增加作用；对低压缺氧小鼠血液中乳酸含量和全血粘度有一定降低作用[3]。川芎中主要含有内酯类、生物碱类、酚类以及挥发油等多种化合物，如二聚藁本内酯、洋川芎内酯 I、川芎三萜、阿魏酸、咖啡酸等多种化学成分；当归主要含有洋川芎内酯双藁苯内酯、阿魏酸、阿魏醛等化学成分[4]。舒脑欣滴丸的药效物质基础尚不明确，作用机制还有待进一步探索，已有研究表明舒脑欣滴丸给药后，洋川芎内酯A，Z-藁苯内酯；Z-藁苯内酯和洋川芎内酯I/H四种成分能透过血脑屏障进入脑组织。本课题拟在前期研究的基础上，研究舒脑欣滴丸中阿魏酸在大鼠体内的吸收、分布、代谢规律，为探讨舒脑欣滴丸的药效物质基础提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 药材和试剂

舒脑欣滴丸(天津中新药业集团股份有限公司第六中药厂，批号为Z20050041)；对照品阿魏酸(上海源叶生物有限公司，批号H27I7L16718)；甲醇(色谱纯)；水(娃哈哈纯净水)；其他试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪(Waters公司，配有2998二极管阵列检测器，自动进样器，Empower色谱工作站)；KQ-500E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TG凯特离心机(蓝城凯特实验仪器有限公司)；氮气吹干仪(上海东方分析设施公司)；XW-80A涡旋混合仪(海门市其林尔雨仪器制造有限公司)；0.22 μm滤膜。

1.3 实验动物

雄性健康SD大鼠[济南朋悦动物繁育有限公司，批号SYXK(鲁)20170023]，体重(280±10)g。实验前饲养3天以适应环境。

2 方法

2.1 色谱条件

Venusil MP C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相∶甲醇-1%冰醋酸水溶液为35∶65，流速为1 mL·min-1，检测波长275 nm，进样量10 μL，柱温30℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液的配制 精密称取阿魏酸对照品适量，置10 mL容量瓶中，加 70%甲醇溶液溶解并定容至刻度，摇匀，得阿魏酸浓度为 200 μg·mL-1的对照品储备液，4℃冰箱保存。使用前稀释成工作溶液。

2.2.2样品混悬液配制 取舒脑欣滴丸20粒，研碎，精密称定 0.855 g(相当于阿魏酸 0.35%)，加2 mL水，混匀，制成样品混悬液，供大鼠灌胃给药。

2.3 血浆样品的处理

取给药后各时间点血浆200 μL，置1.5 mL离心管中，加入50 μL 0.6 mol·L-1HCl，涡旋混匀，加入乙酸乙酯 0.6 mL，涡旋 3 min，5 000 r·min-1离心10 min，取上层有机相，重复提取3次，合并有机相，25℃氮气吹干，取100 μL甲醇复溶，12 000 r·min-1离心5 min，上层清液进样分析。

2.4 阿魏酸药动学研究

取SD大鼠6只，雄性，称重，顺序编号，禁食12 h，自由饮水，分别灌胃给药舒脑欣滴丸药品混悬液(相当于阿魏酸 10 mg·kg-1)，并于给药后 0、0.17、0.33、0.5、0.75、1、2、3、4、8、12 h断尾取血0.5 mL，置 1.5 mL抗凝离心管中，离心取血浆，并灌胃给与相同量的生理盐水，按“2.3”项下方法处理样品，测定阿魏酸浓度，利用 DAS2.1药动学软件统计分析，计算药动学参数。

3 实验结果

3.1 方法专属性考察

分别取大鼠空白血浆，添加阿魏酸对照品的空白血浆，大鼠灌胃给药后的血浆样品，按2.3项下方法处理后进行分析，阿魏酸保留时间为 12.4 min，结果表明空白血浆的内源性物质以及含药血浆中的其他成分与阿魏酸分离度良好，对阿魏酸含量测定无干扰，见图1。

图1 空白血浆(A)、阿魏酸对照品(B)和含药血浆样品(C)HPLC色谱图(峰1为阿魏酸)

3.2 线性关系、最低检测限、定量限考察

取大鼠空白血浆200 μL，加入不同浓度的阿魏酸系列标准溶液，配制成浓度分别为0.12，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg·mL-1的标准样品，在“2.3”项下处理对照品血浆样品，进样分析并记录样品峰面积，以浓度作为横坐标，峰面积作为纵坐标，求得阿魏酸的回归方程为Y=46 309X-18 119(r=0.999 5)，表明阿魏酸在0.12～10.0 μg·mL-1线性范围内线性关系良好。在此色谱条件下进行测定，血浆样品中阿魏酸最低检测限分别为0.04 μg·mL-1，血浆样品中阿魏酸最低定量限分别为0.12 μg·mL-1。

3.3 精密度实验

取空白血浆加入阿魏酸标准溶液，配制成低(0.2 μg·mL-1)、中(2.0 μg·mL-1)、高(8.0 μg·mL-1)3种浓度的含药血浆样品，每个浓度3个样品，日内各浓度重复进样5次，日间连续测定3 d，计算其日内、日间精密度，日内精密度 RSD 为3.54%，日间精密度 RSD 为3.96% ，符合方法学要求。

3.4 稳定性试验

取空白血浆加入阿魏酸标准溶液，配制成低(0.2 μg·mL-1)、中(2.0 μg·mL-1)、高(8.0 μg·mL-1)3种浓度的含药血浆样品，每个浓度3个样品，考察了阿魏酸低、中、高3个质量浓度血浆样品在不同条件下的稳定性，结果表明阿魏酸在上述保存条件下均稳定，符合方法学要求。

3.5 回收率试验

取200 μL空白血浆，制备阿魏酸(0.2、2.0、8.0 μg·mL-1)低、中、高3个不同浓度的血浆样品，每个浓度配制5份，进样测定，记录样品峰面积，与相同质量浓度的对照品峰面积之比计算提取回收率，结果见表2。阿魏酸提取回收率高于79%，符合方法学要求。

表1 血浆中阿魏酸提取回收率(n=5)

3.6 阿魏酸药动学特征

大鼠灌胃后，在不同时间点采血并按所建立的方法测定其血药浓度，采用DAS 2.1药动学软件进行曲线拟合，计算药动学参数，以理论血药浓度与实测血药浓度相关系数最大且AIC值最小为原则，判定其房室模型，阿魏酸在大鼠体内均符合二室模型。平均血药浓度-时间曲线见图2，测定结果及主要药代动力学参数见表2。

图2 舒脑欣滴丸中阿魏酸在大鼠体内的药-时曲线

4 实验讨论

4.1 结果分析

结果表明，大鼠灌胃舒脑欣滴丸后，阿魏酸在大鼠体内的药动学性质均符合开放二室模型。从药代动力学参数可知，阿魏酸达峰时间为(0.17±0.69)h，最大血药浓度为(1.213±0.38)mg·L-1，吸收相半衰期为T1/2α=0.207±0.08h、T1/2β=3.855±4.35 h，表观分布容积为(5.145±2.31)L·kg-1，血浆总清除率为(4.416±2.55)L·h-1·kg-1，其吸收迅速，且生物利用度高，在血浆中清除迅速，可以迅速分布到各组织器官，从而发挥其药效作用。吸收相半衰期都在5 h以内，提示临床用舒脑欣滴丸时，给药时间不能间隔时间太长，否则不能维持有效血药浓度。

表2 舒脑欣滴丸中阿魏酸在大鼠体内主要药动学参数

4.2 实验条件

血浆样品的处理主要采用萃取法及水浴法。阿魏酸本是一种弱酸，血浆样品经过酸化后加入乙酸乙酯比加入乙醚的提取量更高一些[5]。另外阿魏酸对光不稳定，放置的时间不宜过长，并需要在棕色的容量瓶中进行配置，以减少在实验过程中光照对阿魏酸产生降解的可能性，储备液需放置在4℃的冰箱中进行储存。