非洲栽培稻垩白粒率耐热性QTL的定位

曹志斌 李瑶 曾博虹 毛凌华 蔡耀辉 吴晓峰,* 袁林峰,*

非洲栽培稻垩白粒率耐热性QTL的定位

曹志斌1, #李瑶2, #曾博虹1毛凌华1蔡耀辉1吴晓峰1,*袁林峰1,*

[1江西省超级水稻研究发展中心/国家水稻工程实验室(南昌), 南昌 330200；2江西省农业科学院 土壤肥料与资源环境研究所/农业部长江中下游作物生理生态与耕作重点实验室, 南昌 330200;#共2同第一作者；*通信联系人, E-mail: yuanlf2003@sina.com; jxnkzy208@163.com]

【】本研究旨在定位一个稻米垩白粒率高温耐性QTL，为外观品质育种及解析垩白粒率高温耐性的遗传机制提供依据。以非洲栽培稻耐热品种IRGC102309(Steud.)和籼稻品种R9311(L. subsp.Kato)为亲本构建的栽培稻种间染色体片段导入系CSIL05-23为材料构建次级分离群体，结合人工气候室模拟灌浆期高温胁迫处理，采用垩白粒率高温钝感值为评价指标，对非洲栽培稻垩白粒率高温耐性 QTL 进行检测。在BC6F2分离群体，利用单标记分析，发现第5染色体上的SSR标记RM1200与垩白粒率耐热性状极显著正相关（=0.0005）。进一步利用BC6F3和BC6F4分离群体，采用QTL Cartographer 2.5软件和复合区间作图法在水稻第5染色体上的SSR标记RM1200−RM5796区间重复检测到一个灌浆期垩白粒率耐热性QTL, 命名为，分别解释11.4%和17.5%表型变异。根据BC6F4分离群体的纯合重组体表型分组，利用置换作图方法将目标QTL同样定位在SSR标记RM1200−RM5796之间，遗传图距为1.3 cM，物理图距约为333.4 kb。控制垩白粒率耐热性的是一个能够用于稻米外观品质育种的新QTL。

水稻；垩白粒率；耐热性；数量性状位点；基因定位

水稻是全球最重要的粮食作物之一，世界上将近一半人口的能量供应与之直接相关[1]。未来全球气候变暖的趋势对全球水稻生产不利影响将日益加剧，热带及亚热带地区作物生长季节，气温可能会提高3~5℃，将会超过有记录的作物生长季节性高温极值[2]。而且高温热害天气经常与水稻生殖生长关键期相遇，在孕穗期、扬花期以及灌浆期均有发生。因此，培育能够适应未来气候变化的水稻品种，是应对全球气候变暖的迫切需要[3]。灌浆期对水稻籽粒产量与品质形成极为关键。当灌浆期遇到炎热的气候条件，对优质稻米品质的形成很不利，当气温超过35℃，籽粒的灌浆速度加快，灌浆时间缩短，出现高温逼熟现象。产量方面的不利影响，主要表现为籽粒充实度差，千粒重显著降低。稻米品质方面的不利影响，主要表现为垩白粒率高，垩白大，整精米率下降，食味品质变差[4-10]。

水稻灌浆期耐热性属于受多基因控制的复杂数量性状，受外界环境影响明显[11-16]。目前已有学者利用不同作图群体及鉴定指标结合分子标记技术，对灌浆期耐热性相关QTL进行了初步定位。朱昌兰等[17]利用Nipponbare/Kasalath//Nipponbare回交重组自交系群体，以直链淀粉含量为鉴定指标，在第6和9染色体上检测到3个QTL。以胶稠度为鉴定指标，在第4、6、7、8、10和11染色体上分别定位到1个水稻灌浆期耐热相关QTL。朱昌兰等[18]利用Nipponbare/Kasalath//Nipponbare回交重组自交系群体，在第1、4和7染色体上分别定位了一个灌浆期粒重为耐热指标的QTL。Kobayashi 等[19]利用Hana-echizen/Niigatawase构建的F3群体，以稻米外观品质性状背白和腹白为灌浆期耐热性鉴定指标，共检测到3个QTL，其中在第4及第6染色体上分别鉴定到1个白背耐热QTL，在第6染色上定位到一个白背和基白QTL。Shirasawa等[20]利用Kokoromachi/Tohoku 168构建的重组群体在第1和6染色体上个检测到1个白背耐热性QTL。Tabata等[21]利用Koshijiwase/Chiyonishiki构建的重组自交系群体在第1、2和4染色体上共检测到4个稻米白背耐热性QTL。张桂莲等[22]以耐热水稻品系 996 和热敏感水稻品系4628为亲本构建的重组自交系为材料，在第1、3、6、7染色体上检测到8个垩白粒率高温钝感性QTL，在第1、2、4、6、7和10染色体上检测到12个垩白大小高温钝感性QTL，在第1、3、7染色体上检测到4个垩白度高温钝感性QTL。

目前这些定位结果主要是利用亚洲栽培稻籼稻种内或籼粳亚种间杂交构建的初级作图群体分析得到的。本研究利用非洲栽培稻耐热品种为供体亲本，籼稻品种R9311为受体亲本，获得垩白粒率为17.8%的染色体片段导入系CSIL05-23。并通过进一步构建次级分离群体结合人工气候室进行表型鉴定，结合复合区间作图及置换作图法在第5染色体上定位到一个主效垩白粒率高温钝感 QTL。这一工作可为研究垩白粒率高温钝感性的遗传机理，筛选与垩白粒率高温钝感性紧密连锁的分子标记以及下一步的育种应用及图位克隆打下基础。

1 材料与方法

1.1 非洲栽培稻垩白粒率耐热性QTL分析材料

利用亚洲栽培籼稻品种R9311作为受体，非洲栽培稻品种IRGC102309作为供体，2008年夏季开始连续回交5次，自交1次获得BC5F2种子。2010年种植BC5F2群体400株，挑选20株综合农艺性状良好的单株自交套袋收种。2011年冬季将中选材料海南三亚育种试验站加代繁殖获得BC5F3群体。

2012年于南昌试验站中稻季节灌浆期（8月16~26日）经历自然高温胁迫，日平均温度不低于32℃，最高温度不低于36℃。种植BC5F3群体134行，每行8株。成熟后单株收获，脱壳调查垩白性状，以播种时间推迟15 d，9月初开始灌浆的株系的垩白性状值作为正常温度下的表型对照。其中编号为CSIL05-23的染色体片段导入系，高温胁迫处理下垩白粒率平均值为17.8%，而在正常温度下垩白粒率平均值为17.1%，钝感值为1.041，比值接近1，两者差异不显著，对高温表现为强钝感性，同时自交留种，冬季到海南繁殖得到BC5F4种子。将含有目的片段的染色体片段导入系CSIL05-23，分别于2013年、2014年、2015年种植在南昌高安基地，种植4行，行长1.2 m，株距16.5 cm，行距19.8 cm，随机区组设计，设2次重复。2014年夏季在南昌试验站种植200个BC6F2单株。2015年种植RM1200和RM5796片段杂合的BC6F2单株自交获得的BC6F3分离群体380株，2016年种植目标区段杂合的BC6F3单株自交获得的BC6F4群体420株。上述分离群体单株，待幼穗分化至6期左右，带泥移栽至盆钵中继续生长发育。将挂牌标识扬花的稻穗于花后7 d开始用人工气候室模拟高温胁迫14 d。然后移入正常自然条件下成熟5~7 d，调查挂牌标识稻穗垩白粒率。

1.2 人工气候室高温胁迫处理

人工气候室（北京易盛泰和科技）模拟高温胁迫的条件为8:00–17:00，控制在38.0℃±0.5℃，其余时间均为25.0℃±0.5℃。正常对照条件为8:00–17:00控制在32.0℃±0.5℃，其余时间均为25.0℃±0.5℃。所有处理的相对湿度均为75%±5%；光照时间为14 h，光照强度为20 000～25 000 lx。

1.3 垩白粒率高温耐性表型测定

利用JSE-II稻米垩白观测仪考察表型。取整精米100粒，置于观测板上观察，挑选有垩白（包括心白、腹白、背白）的米粒，计平均值作为垩白粒率。以垩白粒率高温钝感值（insensitivity value）表示垩白粒率耐热性。垩白高温钝感值的计算参照钟秉强等[23]方法，钝感值（IV）=1/2，其中1，2分别为高温胁迫下和正常温度条件下的垩白粒率。从理论上讲，钝感值越接近1，该性状越耐高温。

1.4 DNA提取，PCR扩增及多态性标记筛选

应用CTAB法[24]提取DNA，本实验室根据Gramene数据库(http://www.gramene.org)选择SSR引物进行PCR扩增，扩增体系为10 µL，DNA模板l µL。

PCR扩增条件为：94℃下预变性5 min；94℃下变性30 s，57℃下复性30 s，72℃下延伸1 min；35个循环后，72℃下再延伸10 min。扩增产物经非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳，凝胶浓度为6%，电泳缓冲液为0.5倍TBE，220 V恒压电泳1 h，并银染显色。

1.5 QTL分析

根据Mapmaker/Exp 3.0b软件[25]分析多态性标记之间的连锁遗传关系, 构建局部连锁遗传图谱。设定最小LOD值为3.0, 根据Kosambi函数[26]将分子标记重组率换算成遗传图距(cM), 遗传图距最大值为50 cM。利用Windows QTL Cartographer 2.5[27]检测目的性状QTL。利用复合区间作图法(composite interval mapping, CIM)[28]，取LOD值2.5为 QTL存在的阈值,利用模型6进行分析。用SAS统计软件对标记与性状进行单标记相关性分析。根据多态性分子标记对群体单株的基因型检测结果将数据分组。利用SAS统计软件中方差相同的测验检验组间平均数的差异，确定单标记与性状的相关性[29]。通过差异显著性分析，判断控制数量性状的QTL是否与标记连锁。2是标记能够解释性状表型变异的比例，由表型性状与标记的回归方程中的决定系数决定[30]。QTL命名方法参照McCouch等制定的规则[31]。

2 结果与分析

2.1 染色体片段导入系CSIL05-23高温胁迫及常温条件下垩白粒率表现

CSIL05-23在田间高温胁迫和人工气候室模拟高温胁迫条件下垩白粒率分别为17.8%和18.4%，显著低于受体亲本R9311，R9311分别为55.5%和56.8%(图1-A)。CSIL05-23在田间高温胁迫和人工气候室模拟高温胁迫条件下垩白粒率高温钝感值分别为1.04和1.07，R9311分别为2.25和2.30(图1-B)。

2.2 垩白粒率耐热性QTL的初步鉴定

由表1可知，BC6F2群体中垩白粒率高温钝感值表现出极显著差异，且变异幅度较大，存在显著的超亲分离。因此推测非洲栽培稻片段含有降低垩白粒率高温钝感值的优异等位基因，且这些优异位点已在亚洲栽培籼稻中发生了重组并引起了群体表型的变异。偏度和峰度的绝对值均小于1，认为垩白粒率高温钝感值表型均符合正态分布，呈多基因控制的数量性状遗传特点。

从Gramene数据库(http://www. gramene.org) 中选择均匀覆盖水稻基因组的430对多态性SSR引物对CSIL05-23和R9311进行PCR扩增，获得3对具多态性SSR标记，分别为RM488(Chr. 1)，RM5460(Chr. 2)，RM1200(Chr. 5)。利用这3个SSR标记对200个BC6F2分离单株进行检测，发现3个标记基因型均发生分离。根据分子标记结果将数据分组，利用方差相同的测验检验组间平均数的差异，确定标记与垩白粒率高温钝感性状的连锁关系，发现第5染色体上RM1200与垩白粒率高温钝感值呈极显著正相关（=0.0005）。该标记位点的非洲栽培稻增效基因能够显著提高垩白粒率高温钝感性，解释9.4%的表型变异。

**差异极显著(p<0.01), t检验。

Fig. 1. Comparison of heat tolerance of chalky grain rate of CSIL05-23 and R9311 in field and artificial climatic chambers.

表1 亲本及BC6F2、BC6F3、BC6F4群体垩白粒率高温钝感值的表型变异

表2 BC6F3与BC6F4世代灌浆期高温胁迫后垩白粒率耐热性QTL分析

IV indicates insensitive value of heat tolerance of chalky grain rate. X1and X2indicate chalky grain rate under heat stress condition and normal condition, respectively.

2.3 垩白粒率耐高温QTL复合区间作图

为了进一步消除遗传背景的影响，有效确定目标QTL的位置和遗传效应。在BC6F2分离群体中利用RM488、RM5460和RM1200进行渗入片段标记基因型鉴定，将RM488和RM5460基因型为轮回亲本纯合基因型，而目标渗入片段RM1200为杂合基因型的BC6F2单株自交，获得BC6F3和BC6F4次级分离群体进行分析。如表1所示，群体间差异达到极显著水平并存在明显的超亲分离现象。2个世代垩白粒率耐热性状的钝感值均符合正态分布，呈多基因控制的数量性状遗传特点。

根据Gramene数据库, 在第5染色体目标区域附近挑选并合成25对SSR引物进行多态性筛选, 共获得8对多态性SSR标记。将这些具多态性的引物进一步分析整个BC6F3群体，应用Mapmaker/Exp 3.0软件构建分子遗传图谱，该渐渗片段长10.3 cM，标记间平均距离为1.5 cM(图2)。

应用 QTL Cartographer 2.5软件，采用复合区间作图法对BC6F3单株及BC6F4群体垩白粒率高温钝感值，高温胁迫处理下垩白粒率、正常温度处理下垩白粒率分别进行了QTL分析(表2)，三个指标性状在2个世代相同标记RM1200−RM5796区间都定位到目标QTL，增效基因来源于非洲栽培稻。针对目标QTL(a QTL for heat tolerance of chalky grain rate)以垩白粒率高温钝感值为鉴定指标进行QTL分析，发现在2个世代分别可以解释11.3%，17.5%的表型变异。以高温胁迫处理下垩白粒率X1为鉴定指标进行QTL分析，发现在2个世代分别可以解释9.5%，16.7%的表型变异。以高温胁迫处理下垩白粒率为鉴定指标进行QTL分析，发现在2个世代分别可以解释9.5%，16.7%的表型变异。正常温度处理下垩白粒率为鉴定指标进行QTL分析，发现在2个世代分别可以解释12.6%、16.5%的表型变异。

左右箱线图分别表示来自BC6F3和BC6F4群体的1 LOD 和2 LOD 似然区间位置。

Fig. 2. Genetic linkage map and likelihood intervals for QTL associated with heat tolerance of chalky grain rate.

2.4 利用置换作图方法定位

利用上述8个SSR标记对430个BC6F4单株分析，在RM1200和RM5796之间总共得到90个交换单株，通过连锁分析构建了目标区域染色体片段置换图（图3）。根据交换单株标记基因型信息，将90个交换单株中部分纯合体按交换位置信息分为14组。利用置换作图的方法分别利用高温胁迫处理下垩白粒率（X1）、正常温度处理下垩白粒率（X2）、垩白粒率高温钝感值（IV）三个指标性状对进行定位。重组体G1~G7分别携带RM592到RM4777逐渐递减的IRGC102309纯合渐渗片段。G1~G6纯合重组体与R9311之间比较在X1、X2和IV性状上均存在显著差异(<0.05)，与CSIL05-23比较在X1、X2和IV性状上差异不显著。G7纯合重组体与R9311之间比较在X1、X2和IV性状上差异不显著，与CSIL05-23比较在X1、X2和IV性状上差异显著(<0.05)。因此，根据G1~G6和G7纯合重组体与对照之间的差异显著性分析结果把垩白粒率高温钝感QTL界定在RM1200的下游。G8~G14分别携带从RM1200到RM405逐渐递减的IRGC102309纯合渐渗片段。其中，G8纯合重组体与R9311比较，在X1、X2和IV性状上差异显著(<0.05)，与CSIL05-23比较在X1、X2和IV性状上差异不显著。G9~G14纯合重组体与R9311比较，在1、2和IV性状上差异不显著，与CSIL05-23比较在1、2和IV性状上差异显著(<0.05)。因此，G8和G9~G14纯合重组体与对照亲本比较结果把垩白粒率高温钝感QTL界定在RM5796的上游。这些研究结果表明位于SSR标记RM1200–RM5796之间，遗传距离为1.3 cM，物理距离约为333.4 kb。

由380个BC6F3单株的分析数据构建QTL区域的连锁图。BC6F4纯合重组体的后代在灌浆期模拟高温逆境处理后, 根据垩白粒率及钝感值（IV=X1/X2）调查结果将qHTCGR5定位在RM1200和RM5796之间, 根据基因型将90个重组体分为14组。每组的重组体数目及与R9311和染色体片段导入系CSIL05-23之间的垩白粒率高温钝感表型差异显著性在右边标出。“a”表示重组体与R9311的表型值在0.05水平无显著差异：“b”表示重组体与CSIL05-23的表型值在0.05水平无显著差异。

Fig. 3. Mapping ofby a substitution mapping strategy.

3 讨论

非洲栽培稻与亚洲栽培稻同属AA基因组的不同种，两者在进化中属于独立起源种，并且存在明显的生殖隔离现象。需要构建染色体片段导入系或近等基因系来克服种间不育问题。目前通过传统回交结合现代生物技术手段已经能够有效挖掘利用非洲栽培稻的种质特性。非洲栽培稻在当地自然选择及进化过程中，已经具备适应或抵抗高温热害、涝害、干旱、耐盐碱及各种病虫害特性，对亚洲栽培稻品种改良具有重要意义。本研究利用构建的QTL-CSIL群体为鉴定垩白粒率耐热性QTL提供了丰富的遗传信息。除了证实控制目的性状的非洲栽培稻等位基因，在不同世代的遗传效应稳定及方向一致外，而且通过消除背景噪音将的遗传效应值大小进行准确的评估。很显然利用复合区间作图法分析F2群体对这些QTL遗传效应估计的准确性是不足的，实际上目前水稻耐热QTL克隆的成功例子也是得益于高质量近等基因系的培育[32]。

在籽粒灌浆期遇到高温胁迫会导致灌浆速率加快，导致籽粒垩白粒率、垩白大小、垩白度显著增加。垩白相关性状受多个基因/QTL 位点协同调控表达，并且与外界环境因素存在明显的互作效应。目前第5染色体上垩白性状QTL的定位研究已有报道，且都是在田间自然条件下鉴定得到的。Liu等[33]利用2个粳稻品种Koshihikari和C602杂交、自交构建了261个重组自交系(F8)进行垩白性状QTL分析，在第5染色体上鉴定到一个垩白粒率QTL，定位在RM289和RM3437之间，解释18.2%的表型变异。高方远等[34]利用籼稻保持系骨干亲本岗46B与美国水稻品种Lemont多次回交培育的低垩白、窄粒株系K1075与岗46B构建F2群体, 对垩白粒率进行QTL分析，将第5染色体上的垩白粒率QTL定位在RM18004−RM18068之间，该QTL解释52.55%的表型变异。上述2个垩白粒率QTL与区间标记位置均不重叠。因此是一个新的耐热性QTL位点。该位点在BC6F3和BC6F4两个世代被定位在同一个标记区间，遗传距离为1.3 cM，并且遗传效应值较大。这对水稻的生殖期高温胁迫条件下外观品质的改良非常有意义。

置换作图法最早由Paterson提出[35]，并成功应用于QTL精细定位。这种方法已经证明置换作图是一种区分基因多效性及排除连锁累赘的有力工具，可以为QTL的精细定位及图位克隆打下坚实的基础[36-37]。CSIL05-23所含渐渗区域已被证实能够改良受体的垩白粒率高温耐性。在本研究BC6F4群体的置换作图中，我们对纯合交换片段都进行了分析，对不同交换片段的作用效果进行了评估。同时SSR标记在确定重组位置及基因渗入区域边界是非常有效的。与受体亲本相比，通过置换作图发现1.3 cM的IRGC102309渗入片段上存在能够在正常温度下显著降低受体亲本垩白粒率X2值的QTL，在高温胁迫下该片段上QTL也能显著降低受体亲本垩白粒率X1值，并且垩白粒率高温钝感值IV接近1，表现为垩白粒率高温绝对钝感（图2）。由于本研究人工气候室处理群体数量有限，不能用于精细定位的大规模分离群体的表型鉴定，因此本研究置换作图分辨率仍然不能清楚地分辨出X1，X2和IV三个性状是由于基因连锁导致，还是基因的多效性导致这种现象发生。因此，下一步将设计精细定位实验方案，构建高密度局部分子标记遗传图谱，增加QTL精细定位分辨率，分析上述三个性状是否由这个区域上的同一个QTL控制，还是三个QTL紧密连锁影响，为目标QTL的育种应用及相关基因克隆打下坚实的基础。

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QTL Mapping for Heat Tolerance of Chalky Grain Rate ofSteud.

CAO Zhibin1, #, LI Yao2, #, ZENG Bohong1, MAO Linghua1, CAI Yaohui1, WU Xiaofeng1, *, YUAN Linfeng1, *

(1Laboratory of Rice National Engineering, Jiangxi Research and Development Center of Super Rice, Nanchang 330200, China;2Institute of Soil and Fertilizer & Resources and Environment, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Crop Ecophysiology and Farming System for the Middle and Lower Reaches of the Yangtze River, Ministry of Agriculture, Nanchang 330200, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: yuanlf2003@sina.com; jxnkzy208@163.com)

【】The objective of the research is to identify a QTL for heat tolerance of chalky grain rate, so as to provide support forthe appearance quality breeding and analysis of genetic mechanism of rice high temperature tolerance of chalkygrain rate. 【】We developed a chalky grain rate heat-tolerant CSIL(chromosomal segment introgression lines), CSIL05-2, by backcrossing and marker assisted selection with African cultivated rice acc.IRGC102309 (Steud.) as donor parent and Asian cultivated riceR9311 (L. subsp.Kato) as recipient parent. And a QTL for insensitityof heat tolerance of chalky grain rate on chromosome 5 was analyzed using secondary populations from CSIL05-2.【】In a BC6F2segregation populations, the SSR marker RM1200 on chromosome 5 showed significant correlation with heat tolerance of chalky grain rateby single marker analysis（=0.0005）. Using Cartographer 2.5 and the composite interval mapping with BC6F3and BC6F4populations, we further anchored the quantitative trait loci (QTL) associated with heat tolerance of chalky grain rate at filling stage to the same position within a 1.3cM interval, which was designed as qHTCGR and explained 11.4% and 17.5% of the phenotypic variances, respectively.Using homozygous recombinants screened from BC6F4populations,was also detected in a ~333.4 kb region betweenRM11633 and RM11642.【】The QTL controlling the heat tolerance of chalky grain rateis a novelQTL.

rice; chalky grain rate; heat tolerance; QTL; gene mapping

Q343.1+5; S511.32

A

1001-7216(2020)02-0135-08

10.16819/j.1001-7216.2020.9086

2019-07-26;

2019-10-17。

国家自然科学基金资助项目(31560382)；江西省杰出青年科学基金资助项目(2018ACB21026);江西省自然科学基金资助项目(20151BAB214013; 2017BAB204020)；江西省现代农业科研协同创新专项(JXXTCXFY201902)；国家重点研发计划资助项目(2017YFD0301601; 2018YFD0301103)；江西省重点研发计划资助项目(20171ACF60019)。