越鞠丸对功能性消化不良大鼠胃窦黏膜5-HT及胃肠激素水平的影响

叶 影 徐嘉淦 龙惠珍

1.温州市中医院 浙江，温州 325000 2.浙江中医药大学第一临床医学院 3.浙江省中医院

功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）是一种常见的功能性胃肠疾病，可分为餐后不适综合征和（或）上腹痛综合征，临床上主要表现为餐后饱胀不适或餐后早饱，尤其以餐后早饱多见，或者出现中上腹痛、烧灼感，可伴有恶心呕吐、嗳气、便秘等，常规检查均不能发现解释上述症状的器质性、系统性、代谢性疾病[1]。这些胃肠道症状可影响到患者日常进食量，严重者甚至影响日常活动，使患者生活质量下降。FD发病机制尚未完全明确，目前认为与胃肠激素水平失调、胃肠动力障碍、脑-肠轴功能紊乱以及精神心理因素有关。目前FD的西医治疗以多潘立酮、莫沙必利、依托必利、西甲硅油乳等胃肠动力药为主，但长期服药会导致诸多不良反应，如腹泻、腹痛、口干、皮疹、过敏甚至严重心律失常、猝死等[2]。

中医古籍中并未直接出现“消化不良”病名，依据症状，基本归属于“痞满”“胃脘痛”等范畴。越鞠丸出自《丹溪心法》，现代研究发现越鞠丸具有抗抑郁、保护心脏、调节胃肠功能和调节代谢等作用，可应用于睡眠障碍、代谢综合征、胃溃疡、便秘、冠心病等疾病的治疗[3]。本研究拟观察越鞠丸对FD大鼠体重、进食、饮水量及胃排空率的影响，以及对胃窦黏膜5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）含量、血清血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）水平的影响，并探讨其可能的作用机制，为临床应用越鞠丸治疗FD提供实验依据。

1 材料和方法

1.1实验动物与分组 SPF级雄性SD大鼠48只，体重（160±20）g，饲养于浙江中医药大学动物实验中心SPF环境中 [实验动物使用许可证号：SYXK （浙）2016-0148]。饲养环境温度20℃，光照12h，大鼠自由进食、饮水，适应性喂养3d。随后将48只SD大鼠称重，按照随机数字表法分为对照组及实验组。对照组大鼠8只不予特殊处理；实验组40只，进一步随机分为模型组、莫沙必利组、越鞠丸低、中、高剂量组，每组各8只。

1.2实验药物 越鞠丸药物组成：神曲10g，苍术10g，香附10g，栀子10g，川芎10g。以上药物均由浙江省中医院提供，并经过浙江中医药大学药理实验室加工制备，所有药物加10倍水浸泡1h，大火煎煮1h，过滤除去药渣；再加入6倍水煎煮1h，过滤除去药渣，置于旋转蒸发器中浓缩，使生药浓度分别为0.45、0.9、1.8g·mL-1，置于 4℃冰箱备用。枸橼酸莫沙必利片购于江苏豪森药业股份有限公司 （国药准字：H19990315；规格：5mg/片），以蒸馏水溶解，配制成浓度0.15mg·mL-1的混悬液，置于4℃冰箱备用。

1.3主要试剂和仪器 5-HT免疫组化检测试剂盒购于Sant Cruz公司（批号：S5545）；二抗购于福州市迈新生物技术开发公司 （批号：KIT-5006）；VIP酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒购于上海信裕生物科技有限公司（批号：XY-VIP-Ra）；羧甲基纤维素钠购于上海申光食用化学品有限公司（批号：FH45054119）；半固体营养糊由5g羧甲基纤维素钠、8g奶粉、4g糖、4g淀粉、2mL 墨汁、125mL 蒸馏水配成[4]，浓度 1g·mL-1，使用前配置。酶标仪为芬兰Labsystems Multiskan MS公司产品；倒置荧光显微镜及成像系统购于日本Nikon公司；MDF-382EAANSS型超低温冰箱为日本SANYO公司产品。

1.4方法

1.4.1造模及给药 实验组大鼠按照郭氏夹尾法造模[5]。以长海绵钳钳夹大鼠尾部远端1/3处，激怒大鼠，使之与其他大鼠撕打，从而使全笼大鼠都处于暴怒状态，若尾部过度损伤，以0.5%碘伏适量消毒。单次不间断夹尾刺激30min，每隔3h刺激1次，共4次/d，连续刺激7d。评估造模成功后开始给药治疗。对照组及模型组以0.9%氯化钠溶液灌胃，2mL/次，1次/d；莫沙必利组予莫沙必利0.3mg/200g灌胃，2mL/次，1次/d；越鞠丸分为低、中、高剂量组，按照70kg体重成人与200mg体重大鼠的体表面积折算等效剂量比值0.018，计算得出低、中、高剂量分别为 4.5、9、18g·kg-1，分别以上述剂量灌胃，2mL/次，1次/d。各组大鼠均连续灌胃7d。

1.4.2观察指标

1.4.2.1一般状态 造模及治疗时，每日观察记录实验大鼠的精神状态、活动量、皮毛色泽、大便形态等。

1.4.2.2大鼠体重、进食及饮水量测定 每日上午8：00各组予定量的固体颗粒饲料及蒸馏水，至次日早8：00测定剩余量，并每日记录。每日上午9：00称量各组大鼠的体重，并每日记录。

1.4.3胃排空率测定 造模成功并末次给药后禁食禁水24h，每只大鼠以2mL半固体营养糊灌胃，30min后麻醉处死动物，眼球取血4mL，开腹后分离全胃，贲门和幽门处以细线扎紧，滤纸擦干后称重。沿胃大弯将胃剪开，以0.9%氯化钠溶液充分清洗胃内容物，滤纸擦干后再次称重。胃排空率（%）=1-（全胃重-胃净重）/半固体营养糊重量×100%。

1.4.4大鼠胃窦黏膜组织形态观察 将各组大鼠处死后，分离胃窦组织，迅速放入4%多聚甲醛中固定，依次脱水、透明、浸蜡、包埋和切片。每组随机选取2张切片，常规脱水脱蜡，经苏木精、伊红染色后，在光学显微镜下放大100倍观察胃窦黏膜组织形态。

1.4.5胃窦组织5-HT含量检测 每组随机选取2张石蜡切片，常规脱水脱蜡后，采用免疫组化法检测各组大鼠胃窦组织的5-HT含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.4.6血清VIP水平检测 各组大鼠麻醉后眼球取血4mL，4℃下3 000r/min离心10min，分离血清于-80℃超低温冰箱保存，以ELISA法检测血清VIP水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.5统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示；本研究为多样本的均数比较，样本经偏度峰度检验呈正态分布，故主要采用单因素方差分析，满足方差齐性时用LSD法，方差不齐时选用Dunnett’s T3检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1造模评估 夹尾法造模后，实验组大鼠出现乱窜，前肢抬高、站立、撕打，并发出“呼呼”尖叫。夹尾第3天大鼠出现易怒、易惊、对外界声音极其敏感；第5天大鼠打架反应迟缓、少动，大便偏稀；第7天大鼠出现懒动表现，鼠毛枯黄毛躁、脱落，身体消瘦，并有紧张焦虑，与所需FD模型表现符合，且各组造模大鼠未见明显差异。与对照组比较，模型组大鼠进食及饮水量减少，体重减轻，胃排空率明显下降，说明胃肠动力减退。HE染色结果显示，各组大鼠胃窦黏膜未见活动性炎症、糜烂、萎缩、不典型增生等病理改变，证明造模成功。

2.2各组大鼠体重、进食及饮水量比较 造模前，各组大鼠体重、进食及饮水量差异无统计学意义 （P＞0.05）。造模后，与对照组比较，模型组大鼠体重、进食及饮水量下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。给药后，与模型组比较，莫沙必利组和越鞠丸各剂量组大鼠饮水量均明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与莫沙必利组比较，越鞠丸各剂量组大鼠饮水量均明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.3各组大鼠胃排空率比较 与对照组比较，模型组大鼠胃排空率明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，莫沙必利组和越鞠丸中、高剂量组大鼠胃排空率增加，差异具有统计学意义 （P＜0.05）；与莫沙必利组比较，越鞠丸中、高剂量组大鼠胃排空率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 各组大鼠体重、进食及饮水量比较（±s）Tab.1 Comparison of body weight,food and water consumption in each group(±s)

表1 各组大鼠体重、进食及饮水量比较（±s）Tab.1 Comparison of body weight,food and water consumption in each group(±s)

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与莫沙必利组比较，ΔP＜0.05Note：Compared with control group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05;compared with Mosapride group，ΔP＜0.05

体重（g） 进食量（g） 饮水量（mL）造模前 造模后 给药后 造模前 造模后 给药后 造模前 造模后 给药后对照组 161.14±5.02 207.07±5.12 260.58±7.81 16.22±1.79 16.57±1.76 20.74±1.05 25.40±0.84 26.29±1.31 31.71±0.76模型组 163.71±7.62 174.7±10.09*233.33±13.35*15.86±1.13 12.10±1.95* 17.13±2.74*25.72±1.22 21.23±1.66* 27.89±0.73*莫沙必利组 157.80±6.05 173.74±6.52* 232.31±7.10* 16.68±1.76 12.77±2.06* 19.29±0.87 25.96±0.41 22.46±2.02* 30.34±1.52#越鞠丸低剂量组 160.54±5.36 173.78±9.34*229.87±13.94*16.43±0.58 12.73±2.13*20.08±1.48 26.10±0.64 20.90±1.68*32.97±1.48#Δ越鞠丸中剂量组 159.87±6.90 173.29±7.57*230.80±11.32* 16.52±1.48 12.03±1.90*20.07±1.60 26.02±1.07 21.64±0.71*34.44±2.08#Δ越鞠丸高剂量组 158.29±8.03 174.99±9.45*231.15±13.64*16.92±0.94 12.68±1.77*20.36±2.14 25.44±0.82 22.44±1.77*33.88±1.74#Δ组别

2.4各组大鼠胃窦组织5-HT含量比较 与对照组比较，模型组大鼠胃窦组织5-HT含量显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，莫沙必利组和越鞠丸中、高剂量组大鼠胃窦组织5-HT含量均升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与莫沙必利组比较，越鞠丸低中剂量组5-HT含量较低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；高剂量组差异也无统计学意义（P＞0.05）。见表 3、图 1。

2.5各组大鼠血清VIP水平比较 与对照组比较，模型组大鼠血清VIP水平明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05)；与模型组比较，莫沙必利组和越鞠丸中、高剂量组大鼠胃血清VIP水平均下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与莫沙必利组比较，越鞠丸中、高剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表2 各组大鼠胃排空率比较（±s）Tab.2 Comparison of gastric emptying rate in each group（±s）

表2 各组大鼠胃排空率比较（±s）Tab.2 Comparison of gastric emptying rate in each group（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05Note：Compared with control group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05

胃排空率（%）对照组 8 49.25±12.80模型组 8 18.81±6.78*莫沙必利组 8 36.14±16.74#越鞠丸低剂量组 8 18.57±2.96越鞠丸中剂量组 8 43.21±20.52#越鞠丸高剂量组 8 48.50±9.82#组别n

表3 各组大鼠胃窦组织5-HT含量比较（±s）Tab.3 Comparison of 5-HT content in gastric antrum in each group(±s)

表3 各组大鼠胃窦组织5-HT含量比较（±s）Tab.3 Comparison of 5-HT content in gastric antrum in each group(±s)

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05Note：Compared with control group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05

5-HT含量对照组 8 26.011±1.531模型组 8 13.727±2.178*莫沙必利组 8 24.832±2.705#越鞠丸低剂量组 8 14.557±1.039越鞠丸中剂量组 8 19.176±1.703#越鞠丸高剂量组 8 24.513±4.144#组别n

图1 各组大鼠胃窦组织5-HT的表达（400×）Fig.1 Expression of 5-HT in gastric antrum in each group(400×)

3 讨论

前期临床观察中，笔者发现FD患者多有胃脘胀满、痛或不痛、不欲食、嗳气、大便不畅、舌质偏红或舌苔黄腻等特点，同时多存在情志抑郁或焦虑，属于“郁证”型的功能减退性脾胃病。气郁则中焦气机阻滞，或夹食积、血瘀、痰积、湿阻，亦或化火。越鞠丸出自《丹溪心法·卷三》[6]，由香附、川芎、焦山栀、神曲、苍术组成，对情志抑郁焦虑导致的FD患者疗效颇佳。方中香附行气解郁，为君药；川芎治血郁，可助香附行气为臣；栀子清热泻火，以治火郁；苍术燥湿，以治湿郁；神曲消食，以治食郁，共为佐药。香附为行气解郁之要药，药理研究发现，香附不仅具有抗抑郁作用，同时也可促进胃肠动力[7]。川芎为行气活血解郁之良药，现代药理研究证实，川芎能改善血管内皮功能，降低血流阻力，并能抗血小板聚集[8]。栀子泄热除烦，具有抗炎镇痛、保肝利胆、调节胃肠功能、保护神经、抗焦虑等功效[9]。苍术行气化湿解郁，现代药理研究指出，苍术具有抗胃溃疡、调节胃肠运动以及提高消化吸收功能的作用[10]。神曲健胃消食，富含淀粉酶、蛋白酶等成分，其中酵母菌可调节肠道菌群，能够促进胃肠动力[11]。

表4 各组大鼠血清VIP水平比较（±s）Tab.4 Comparison of serum VIP level in each group(±s)

表4 各组大鼠血清VIP水平比较（±s）Tab.4 Comparison of serum VIP level in each group(±s)

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05Note：Compared with control group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05

VIP（ng·L-1）对照组 8 110.75±9.03模型组 8 191.67±17.59*莫沙必利组 8 146.38±18.09#越鞠丸低剂量组 8 177.61±13.87越鞠丸中剂量组 8 153.87±12.91#越鞠丸高剂量组 8 149.12±10.64#组别n

从中医理论来看，采取郭氏夹尾法复制的FD大鼠模型，较符合“怒伤肝，久则郁”的观点。有研究显示，FD的发病与胃肠激素水平紊乱相关[12]。5-HT、VIP均为胃肠激素的重要组成成分。5-HT是普遍存在于中枢神经系统和消化系统的神经递质，作为脑-肠肽，与消化道功能活动关系密切。人体消化道黏膜中的5-HT含量约占人体总含量的90%，其余少部分存在于血小板和中枢神经系统中。胃肠道广泛分布的5-HT及5-HT受体的异常改变可导致胃肠蠕动功能、感觉功能等的异常。近年来，国内外关于5-HT与FD发病相关性的研究取得了较大进展。朱良如等[13]认为，近端胃黏膜中5-HT合成的增多以及5-HT1A受体表达水平的增高，在一定程度上导致了胃机械感觉过敏。寻庆英等[14]采用自拟中药通腑汤进行动物实验，发现大鼠胃动力增加，而且其十二指肠及空肠黏膜中5-HT含量也明显增加。另外，一些可调节人体内5-HT含量的促胃动力药（如莫沙必利、西沙比利等）、抗抑郁药和抗焦虑药（如氟西汀等）能有效改善FD患者的症状，延缓复发。本研究结果显示，模型组大鼠胃窦组织5-HT含量明显降低，胃肠推动力下降，与上述研究一致，说明5-HT的含量降低与FD的发生发展有着密不可分的关系。

VIP是重要的抑制性肽类神经递质之一，参与调节胃肠动力、松弛胃肠道平滑肌和括约肌、松弛胆囊等。VIP对肠道运动具有抑制作用，可使胃肠道动力不足，而VIP水平的下降可促进胃肠平滑肌的收缩，从而减少食物的停留时间[15]。有研究显示，电针治疗可降低FD模型大鼠胃肠道VIP水平，加速胃排空及小肠推进率[16]。本研究中模型组大鼠血清VIP水平升高，胃肠动力下降，而越鞠丸能下调VIP水平，改善食欲、促进胃肠动力，缩短食物在胃肠道的停留时间。

莫沙必利作为强效选择性5-HT4受体激动剂，通过兴奋胃肠道胆碱能中间神经元和肌间神经丛的5-HT4受体，促进乙酰胆碱释放，从而促使胃肠道运动加强，是临床常用的促胃动力药物。本实验中以莫沙必利作为阳性对照，结果表明越鞠丸能够提高胃窦黏膜5-HT含量，增强胃肠动力，增加大鼠进食量及饮水量，其作用与莫沙必利组比较差异无统计学意义。

综上所述，越鞠丸能够改善FD大鼠的消化功能，增加胃排空率，其中高剂量组作用最强，其作用机制可能与增加胃窦组织5-HT含量，下调VIP水平有关。本研究结果仅证实越鞠丸能提高胃肠道5-HT含量，而是否影响中枢神经系统内5-HT含量尚不明确，有待进一步研究。