一株粘质沙雷氏菌对污染水体中镉的去除条件研究

骆纵纵，陶梦婷，张瑾，周睿

(1.安徽建筑大学 环境与能源工程学院，安徽 合肥 230601；2.安徽省水污染控制与废水资源化重点实验室，安徽 合肥 230601)

0 引言

水体污染问题已成为亟需解决的环境问题之一[1]，而重金属作为水体中一类典型的污染物，不仅具有毒性还具有生物累积性，故对环境生物的生存和人类健康都具有潜在风险[2]。

近年来水体中镉(Cadmium，Cd)引起的饮用水安全问题频频发生[3]。云南省楚雄市的龙川江和广东省韶关市的北江均是重要的经济带和饮用水水源地，且龙川江楚雄段和北江韶关段均发生过严重Cd 污染事件，经检测发现两江流域断面的总Cd含量分别超标36.4 倍和12 多倍，致使周围居民饮用水安全难以得到保障[4]。杨晓辉[5]等对巢湖水系进行了Cd 污染检测，发现合肥市区的南淝河部分采样点中Cd 的富集系数在10.0～21.0，在11 个采样点中，有10 个采样点的Cd 含量均值超过660 μg/kg，且有3 个采样点的Cd 含量已高于1000 μg/kg，检测数据表明该水体中Cd 污染程度非常严重。龙江河也曾爆发过Cd 污染事件，据检测数据显示该流域水体中Cd 浓度最高超标已达80 倍以上[6]。因此，水体中Cd 污染现象已非常严重。

水体中的Cd 污染对自然环境和人类健康都造成了诸多危害。李海芹等[7]研究发现水体的重金属污染不仅会直接对水生动物的新陈代谢、器官发育、后代繁衍及基因稳定产生严重影响，也会对水生植物的叶绿素含量、细胞酶的分泌、光合作用及呼吸作用造成直接的损伤，且当水体重金属污染严重时，会直接造成水生动植物的死亡。王俊能等[8]将广西龙江水体中的多种鱼类作为实验对象，研究发现在水体中Cd 污染突发初期，鱼肌肉中的Cd 含量较高，且突发点周围居民食用受Cd 污染的鱼类所导致健康危害的风险值高达9.03×10-5·a-1。吴思英等[9]对福建地区长期受Cd 污染的6 个自然村中5 年人口死亡情况进行了研究，发现当地新生儿的死亡率远高于同县的非污染区，且污染区居民因患有恶性肿瘤、呼吸系疾病和消化系疾病而死亡的概率也远高于非污染区。由此看来水体中的Cd污染问题十分严峻，并已对水环境及人体健康构成了严重的威胁。

在目前的水体重金属污染治理方法中，微生物治理方法具有低成本、作用面积较大、体积较小以及对环境的适应能力强等优点，且相比于传统治理方法，微生物净化水体效果更加明显，且适用于多种水体中重金属和有毒污染物的去除[10]。黄飞[11]以筛选所得的耐Cd 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus RC-1)作为微生物吸附剂，发现该细菌对水体中Cd2+污染的去除能达到较好的效果，且避免了二次污染的产生。因此，利用微生物治理水体中重金属污染问题具有可行性。

本文将已从土壤中筛选出的一株对重金属Cd具有耐性的粘质沙雷氏菌(AR1 KX343948.1)作为实验菌株，探讨在不同的药物浓度、加菌量、菌龄、pH 值和处理时间下耐性菌对Cd 的去除效果，以明确耐性菌对Cd 的较优去除条件。研究结果将为重金属污染水体的治理提供数据和方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验菌种及试剂

实验菌种：粘质沙雷氏菌(AR1 KX343948.1)。事先从安徽建筑大学校园林地新鲜土壤样品中筛选所用菌株，其筛选鉴定方法见文献[12]。

实验试剂：胰蛋白胨、牛肉膏、NaCl、CdCl2·2.5H2O、Cd 标准溶液。以上试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器设备

GZ2100 高压蒸汽灭菌锅；SF-CT-1A 净化工作台；HQZ-82 恒温摇床；SHP-250FE 智能生化培养箱；TG16K-II 台式高速离心机；UV-5100 紫外可见光分光光度计；SA8 振荡器(BioCote)；Optima8000电感耦合等离子体光谱仪(PerkinElmer)。

1.2 实验方法

1.2.1 菌体及菌悬液的制备

挑取2～3 环菌落于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在30 ℃，150 r/min 条件下培养。24 h 后8000 r/min 离心10 min 并倒尽上清液，再用蒸馏水清洗并离心，重复两次，得到湿润菌体。再用移液枪吸取蒸馏水反复吹打湿菌体，并稀释菌悬液，控制其OD600 值在0.7 左右，再将菌悬液震荡30 s，即得菌悬液，备用。

1.2.2 Cd 的测定方法及其去除率的计算公式

(1)Cd 的测定方法

用电感耦合等离子光谱仪测定Cd 的浓度。

(2)Cd 去除率的计算公式

式中：Co 为空白组中Cd 的浓度，mg/L；Co 为实验组中Cd 的浓度，mg/L。

1.2.3 耐性菌对Cd 去除条件的研究

(1)药物浓度及加菌量对耐性菌去除Cd 的影响

配置3、6、12.5 和25 mg/L 的含Cd 液体培养基，菌龄为4.5 h，调节pH 为7.2～7.4，将制备好的菌液以1%、2%、3%、4%和5% 的比例加入培养基中，每组设三个平行两个空白，在30 ℃和150 r/min 条件下处理48 h 后取样，离心取上清液过0.45 μm 滤膜，测定Cd 含量并计算去除率。

(2)菌龄对耐性菌去除Cd 的影响

在制备菌悬液时，选择在处理时间为4.5、8、12和24 h 时离心制备，得到相应菌龄的菌悬液。配置3 mg/L 的含Cd 液体培养基，调节pH 为7.2～7.4，向培养基中加入比例为4%的菌悬液，每组设三个平行两个空白，在30 ℃和150 r/min 条件下处理48 h 后取样，离心取上清液过0.45 μm 滤膜，测定Cd 含量并计算去除率。

(3)pH 对耐性菌去除Cd 的影响

配置3 mg/L 的含Cd 液体培养基，调节pH 值分别为4.5、6.0、7.4、8.0 和9.4，菌龄为4.5 h，将菌悬液按4% 的比例加入含Cd 培养基中，在30 ℃和150 r/min 条件下处理48 h 后取样，离心取上清液过0.45 μm 滤膜，测定Cd 含量并计算去除率。

(4)处理时间对耐性菌去除Cd 的影响

配置一系列3 mg/L 的含Cd 液体培养基，用NaOH 溶液调节pH 值为9.4，菌龄为4.5 h，将菌悬液按4% 的比例加入含药培养基中，在30 ℃和150 r/min 条件下分别处理4、8、12、24、48 和96 h后取样，离心取上清液过0.45 μm 滤膜，测定Cd 含量并计算去除率。

2 结果与讨论

2.1 药物浓度及加菌量对耐性菌去除Cd的影响

图1 药物浓度及加菌量对耐性菌去除Cd的影响

该粘质沙雷氏菌对Cd 的耐受浓度能达到1000 mg/L[13]，故耐性菌在本实验所选Cd 浓度下均能正常存活。由图1 可得，随着Cd 初始浓度的增大，粘性沙雷氏菌对Cd 的去除率在下降，当Cd 为3 mg/L 去除效果最好。除药物浓度外加菌量对耐性菌去除Cd 的效果也有影响，当Cd 的浓度为3 mg/L 时，粘性沙雷氏菌对Cd 的去除率在57%作右，且随加菌量的增大，去除率也在增大；当Cd的浓度为3 mg/L 且加菌量为4% 时，去除率达到峰值，峰值为69.83%。当Cd 的浓度为6 mg/L 时，随加菌量的增大，耐性菌对Cd 的去除不断升高，最高时可达58.69%。当Cd 的浓度为12.5 mg/L时，耐性菌对Cd 的最高去除率为45.87%，且加菌量的增大，会抑制耐性菌对Cd 的去除。当Cd 的浓度为25 mg/L 时，耐性菌对Cd 的最高去除率为20.84%，且加菌量的变化对Cd 去除率的影响较小，分析其原因在于浓度相对较高时，菌株表面的吸附位点已达到饱和，其吸附量相比于对高浓度的溶液来说较小，故呈现为高浓度重金属环境中加菌量对重金属的去除率影响不显著；在Cd 的浓度较低时，Cd 的去除率随加菌量增加而增大，这说明在重金属环境中，微生物数量的增加能提供更多的吸附位点，只要微生物表面吸附位点未达到饱和，则菌株对Cd 的去除率就会增加。邹水林[14]研究发现Citrobacter sp.E 对重金属Cu2+具有去除作用，且菌体添加量的增加，对Cu2+的去除率呈先升后降的趋势，当菌体添加量为20g/L 时，Cu2+的去除率增加到最大值，此后，当菌体添加量继续增加时，由于结合位点逐渐饱和，故Cu2+的去除率有所减小。LONG 等[15]研究发现随着工业废水中铅离子初始浓度的增大改性双孢蘑菇菌(Agaricus bisporus)对其去除率逐渐降低。即Cd 的初始浓度和耐性菌的加菌量均会对耐性菌去除Cd 的效果产生一定的影响。低浓度会促进耐性菌的生长，但当浓度过高时会抑制耐性菌的生长。

2.2 菌龄对耐性菌去除Cd的影响

由图2 可得，当菌龄为2 h 时，粘质沙雷氏菌对Cd 的去除率为33.24%，且在菌龄为2 h 到4.5 h时，耐性菌对Cd 的去除率不断增大。当菌龄为4.5 h 时，粘质沙雷氏菌对Cd 的去除率最大，最大值为33.92%。在菌龄为4.5 h 到24 h 时，随菌龄的增加，粘质沙雷氏菌对Cd 的去除率逐渐降低。其原因在于4.5 h 时细菌生长能力强于8、12 和24 h，微生物生长旺盛，繁殖能力强，同时，菌体的活性较高，故加入含药培养基之后，能快速适应环境和繁殖，对重金属的去除作用也较为显著。但随菌龄的增加，微生物的生长缓慢，甚至死亡，故随着菌龄的增大，Cd 的去除率降低。已有研究表明，菌体在不同的生长阶段，其对重金属的去除能力也不同，主要是因为不同生长阶段的菌体细胞表明的代谢物质含量不同，这进一步影响了菌体与重金属的结合能力[14]，即表明菌龄与菌的活性相关，菌龄也是对重金属去除效果的影响因素之一。

图2 菌龄对耐性菌去除Cd的影响

2.3 pH对耐性菌去除Cd的影响

由图3 可得，pH 对粘质沙雷氏菌去除重金属的影响较大，根据专利文献资料的实验过程及相关数据查证可得：耐性菌对pH 的耐受范围是4～10[15]，故耐性菌在实验所设置的pH 条件下可以正常生存。pH 较低，即溶液呈酸性时，粘质沙雷氏菌对Cd 的去除率较低，但随着pH 的升高，去除率逐渐增高。在pH 为9.4 时，耐性菌对Cd 的去除率达到最大值，此时去除率为71.14%。沈薇等[16]在对木霉活细胞吸附Pb(Ⅱ)机理的研究中，得出细胞壁上的各种基团的活性与pH 值紧密相关。故分析本文中pH 不同去除效果不同的原因为：pH 较低时，H+和H30+与重金属离子之间可能存在竞争作用位点的情况，从而导致重金属的去除率降低，这与张丹[17]等的研究结果具有一致性。

图3 pH对耐性菌去除Cd的影响

2.4 处理时间对耐性菌去除Cd的影响

根据该粘质沙雷氏菌的生长周期为18 h[18]，本研究分别在处理为4、8、12、24、48 和96 h 后取样，并分析处理时间对耐性菌去除Cd 的影响。由图4可得，处理时间越长，粘质沙雷氏菌对Cd 的去除率越高。在4、8 和12 h 时，耐性菌对Cd 的去除率较低均在46% 左右；随着处理时间的延长，24、48和96 h 时去除率分别达到52.21%、71.70% 和91.00%。随着处理时间的增加，溶液中菌株的数量同样增加，这样菌株为重金属离子提供的作用位点也越多，微生物通过分泌胞外物质固定重金属，那么菌株数量的增加，虽然导致生长存在竞争，但分泌物的量保持增加，重金属的去除率同样提高[19]。

图4 处理时间对耐性菌去除Cd的影响

3 结论

在实验条件范围内，当Cd 浓度在3 mg/L，加菌量为培养液的4%，pH 为9.4，菌龄为4.5 h 及处理时间为96 h 时，粘质沙雷氏菌(AR1 KX343948.1)对重金属Cd 的去除效果达到最优，且最高去除率为91.00%。粘质沙雷氏菌对Cd 的去除效果在偏低浓度(3～6mg/L)条件下更加显著，对3 mg/L 的Cd 的去除效率最高，且随加菌量的增加耐性菌对Cd 的去除总体呈上升趋势。但在Cd 的浓度为12.5 mg/L 时，加菌量的增加会抑制耐性菌对Cd的去除。此外，随着处理时间的增加，耐性菌对Cd的去除率不断地增加。