高效液相色谱法与液质联用仪法同时测定15批次化妆品中5种限用防腐剂的比较研究

漆爱明毛丽秋，肖树雄，余 燕

(1.广东省药品检验所，中国 广州 510300；2.湖南师范大学化学化工学院，中国 长沙 410081)

随着人们生活水平的不断提高，化妆品已成为日常生活中必不可少的消费品。在化妆品的生产、使用和保存过程中，为免受致病性和非致病性微生物污染，化妆品生产企业会添加各类防腐剂，这不仅可以延长保质期和货架期，还能确保产品的安全性。但研究表明，长期使用含高浓度防腐剂的化妆品会引起过敏性和接触性皮炎等一系列副作用[1，2]，甚至致癌[3-5]。

《化妆品安全技术规范》(2015版)中对我国允许使用的 51 项防腐剂进行了限量规定，收载了11个检测方法，涵盖19类24种化合物的测定[6]。用于化妆品中防腐剂的检测方法有分光光度法、气相色谱法[7-9]、液相色谱法[10-12]、气相色谱-质谱法[13,14]、液相色谱-质谱法等。同时测定氯己定、苄氯酚、氯二甲酚、o-苯基苯酚和p-氯-m-甲酚5种限用防腐剂的方法未见报道。从近年化妆品检验的结果来看，我国化妆品中防腐剂的检出率高，为加强对化妆品的卫生监督和日常管理，有必要研究化妆品中防腐剂含量的快速检测方法。本文拟采用高效液相色谱法和高效液相色谱质谱联用仪法建立对化妆品中5 种防腐剂的快速测定方法，并分别用于检测非蜡质和蜡质类两类化妆品。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱：Agilent 1200高效液相色谱仪配二极管阵列检测器； 液质联用仪：Agilent Technologies 6430 Triple QUAD LC/MS； Mettler Toledo XS205 和 Sartorius CPA224S电子天平；KQ-300DE型数控超声波清洗器； PB-10 pH计；LG10-2.4 A离心机；涡流振荡器(美国IFA 公司)。苄氯酚(东京化成工业株式会社，C0161)，p-氯-m-甲酚(Acros Organics,BE,109480050)，氯己定(Dr. Ehrenstorfer GmbH，C 11310000)，o-苯基苯酚(Dr. Ehrenstorfer GmbH，C 16070000)，氯二甲酚(东京化成工业株式会社，C0161)标准品(纯度均大于96%)；甲醇和四氢呋喃(色谱纯，德国Merck 公司)，甲酸(色谱纯)，乙酸铵(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，实验用水为一级水。

1.2 液相色谱和液质测定条件

液相色谱测定条件：色谱柱: Kromasil 100-5 C18柱，250 mm×4.6 mm×5 μm；流动相：甲醇(C相)和0.025 mol/L磷酸二氢钠水溶液(D相，用磷酸调节pH至3.8)，采用梯度洗脱，洗脱程序：0～10 min，55%～65%(C)，45%～35%(D)；10～15 min，65%～80%(C)，35%～20%(D)；15～20 min，80%～90%(C)，20%～10%(D)；20～22 min，90%～55%(C)，10%～45%(D)；22～26 min，55～55%(C)，45～45%(D)。流速1.0 mL/min; 柱温: 25 ℃; 检测器扫描范围210～400 nm; 进样量10 μL; 采用外标法定量。

氯己定液质测定条件：色谱柱：资生堂SPOLAR C18，250 mm×4.6 mm×5 μm；流动相：0.1%甲酸甲醇，0.1%甲酸水溶液(体积比80∶20)，等度洗脱，流速：0.2 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：1 μL；离子化模式：电喷雾正离子化(ESI+)；雾化气：氮气，241 379.3 Pa(35 psi)；干燥气：氮气，流速10 L/mim，温度350 ℃；喷雾电压：4 kV；碰撞气：氮气；检测模式：MRM模式，检测条件见表1。

p-氯-m-甲酚、o-苯基苯酚、氯二甲酚、苄氯酚液质联用测定条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，2.1×100 mm×1.8 μm；柱温：25 ℃；进样量：1 μL；流动相：乙腈(B相)和0.2%乙酸铵、0.2%乙酸混合液(D相)；梯度洗脱，流速：0.3 mL/min；梯度洗脱程序：0～4 min，60%～90%(B),40%～10%(D)；4～5 min，90%～90%(B)，10%～10%(D)；5～7 min，90%～60% (B)，10%～40%(D)。离子化模式：电喷雾负离子化(ESI-)；雾化气：氮气，241 379.3 Pa(35 psi)；干燥气：氮气，流速12 L/mim，温度350 ℃；喷雾电压：4 kV；检测模式：MRM模式，检测条件如表2。

表2 多反应监测模式下p-氯-m-甲酚、o-苯基苯酚、氯二甲酚、苄氯酚的质谱分析参数

1.3 标准储备溶液的配制

用甲醇(色谱纯)作溶剂，称取适量的各物质标准品置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成5种防腐剂原混合标准储备液，见表3。

表3 各物质贮备溶液浓度及标准系列浓度 单位：mg·L-1

1.4 样品来源及处理

在各大超市随机购买15种化妆品样品，按种类分为:非蜡质(液体类、粉类、膏霜类)和蜡质类，按不同类型分类统计分析。

1.4.1 不含蜡质的化妆品如护肤类、香波、粉等 准确称取试样约0.4 g(精确至1 mg)，置于10 mL具塞比色管中，加甲醇(色谱纯)约5 mL，在漩涡混匀器上振荡1 min，加入饱和氯化钠溶液2 mL，用甲醇(色谱纯)稀释至10 mL，混匀，超声提取15 min，再以8 000 r/min离心15 min，过0.45 μm滤膜(作为液相待测液)，取过滤液1 mL于10 mL比色管中，用甲醇定容至刻度，过0.22 μm滤膜作为液质待测液。

1.4.2 含蜡质的化妆品如唇膏、口红等 准确称取试样约0.4 g(精确至1 mg)，置10 mL具塞比色管中，加四氢呋喃(色谱纯)1 mL，在漩涡混匀器上振荡1 min，加饱和氯化钠溶液1 mL，用甲醇(色谱纯)稀释至10 mL，混匀，超声提取15 min，再以8 000 r/min离心15 min，过0.45 μm滤膜(作为液相待测液)，取过滤液1 mL于10 mL比色管中，用甲醇定容至刻度，过0.22 μm滤膜作为液质联用仪待测液。

若提取液经0.45 μm滤膜过滤后滤液浑浊，则先将提取液用滤纸过滤后再经0.45 μm滤膜过滤。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱法和液质联用仪法线性范围和回归方程的比较

在1.2测定条件和1.4提取条件下，对该方法的线性范围进行验证，结果见表4。参考限度范围要求，配制系列浓度标准溶液，得到目标化合物的线性范围、线性方程和相关系数，5 种防腐剂在其各自的线性范围内线性关系良好，液相方法相关系数均大于 0. 999；液质方法相关系数均大于 0. 990。

表4 5种防腐剂的线性范围、回归方程、相关系数(R2)

2.2 液相色谱法和液质联用仪法检出限及定量限的比较

在最优测定条件和提取条件下，对检出限(LOD)和定量限(LOQ)进行测定，结果见表5。采用样品空白基质溶液稀释标准溶液，以3倍信噪比和10倍信噪比确定两种方法的检出限和定量限。关于5种防腐剂的检出限液相色谱检测法和液质联用仪检测法分别为 0.84～1.96 ng和0.004～0.010 ng；定量限分别为2.52～9.81 ng和0.01～0.03 ng，由表5可知，5种防腐剂的检出限、定量限、检出质量分数、定量质量分数，液相色谱法分别比液质联用仪法高。在测定氯己定、苄氯酚、氯二甲酚、o-苯基苯酚和p-氯-m-甲酚5种防腐剂的检测过程中，液质联用仪法仪器的灵敏性优势凸显，但从性价比和实验仪器的普及性上考虑，液相色谱法的适用普及性优于液质联用仪法。

表5 5种防腐剂的检出限、定量限、检出质量分数、定量质量分数

2.3 液相色谱法和液质联用仪法精密度的比较

液相色谱法分别平行测定高浓度(标准系列溶液2的浓度)6次作为本实验的精密度；液质联用仪法分别平行测定中浓度(标准系列溶液3的浓度)6次作为本实验的精密度，由表6可知，液相高浓度对应的组分精密度的相对偏差为0.4%～1.1%，液质联用仪对应组分精密度的相对偏差为1.0%～2.8%。液相色谱法的精密度的相对偏差比液质联用仪法的精密度的相对偏差小，实验的随机误差液相色谱法比液质联用仪法小，实验的再现性液相色谱法比液质联用仪法好。

2.4 液相色谱法和液质联用仪法加标回收实验和实验的重复性比较

分别对2种基质(非蜡质类和蜡质类)同一基质样品分别进行5种(p-氯-m-甲酚、苄氯酚、氯己定、o-苯基苯酚、氯二甲酚)成分高低2个浓度的加标回收实验,6份回收率测定结果的相对标准偏差作为各不同化妆品基质中含高、低浓度待测成分时的测定重复性(见表7)。液相色谱法：加入量为高浓度时，5种成分的回收率范围为103.7%～113.7%，相对标准偏差为0.5%～2.5%；加入量为低浓度时，5种成分的回收率为108.7%～119.8%，相对标准偏差为0.9%～3.4%。液质联用仪法：加入量为高浓度时，5种成分的回收率为77.6%～117.2%，相对标准偏差为1.8%～4.7%；加入量为低浓度时，5种成分的回收率为71.2%～114.6%，相对标准偏差为1.0%～5.2%。液相色谱法的回收率的相对标准偏差比液质联用仪法的回收率的相对标准偏差值低，由实验数据可知，液相色谱法比液质联用仪法系统误差小，重复性高，实验的可靠性好。

表6 5种防腐剂的精密度 (n=6)

表7 2种基质(非蜡状和蜡质类)的加标回收率及重复性 (n=6)

续表

2.5 液相色谱法和液质联用仪法检测样品

应用所建立液相色谱法和液质联用仪法，分别对实际样品进行了分析，结果如表8所示。

表8 实际样品中5种防腐剂的检测结果

“—”5种组分均未检出。

3 结论

本文建立了高效液相色谱法与液相色谱质谱联用仪法分别对2种基质类型15批次化妆品的5种限用防腐剂氯己定、苄氯酚、氯二甲酚、o-苯基苯酚和p-氯-m-甲酚的测定方法。两种方法操作简便，分离效果都好，实验数据表明，高效液相色谱法比液相色谱质谱联用仪法实验的重现性和可靠性，但选择性和灵敏度稍差。运用建立的两种方法分别对实际样品进行了分析检测，两种方法对实际样品5#、6#、8#的氯二甲酚和o-苯基苯酚的检测结果非常吻合，但对实际样品7#的醋酸氯己定的测定，结果相差较大(测定结果见表8)，原因是液质联用仪法在加标回收中醋酸氯己定回收偏低，实验的重复性较差。比较两种方法的实验数据，结果表明液质联用仪具有高的选择性和灵敏度，更适合用于5种限用防腐剂的定性分析；而高效液相色谱法具有好的重复性和准确性，更适合用于5种限用防腐剂的定量分析。