冬季自然降温过程中阿拉伯婆婆纳与白三叶生理指标的变化特征

黄萍， 高红梅， 陈云， 孙龙飞

(1.河南农业职业学院，河南 中牟 451450； 2.河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002)

低温胁迫直接影响着草坪的质量、绿期长短及越冬率，成为制约中国北方草坪业发展的主要因子之一[1]。若能开发当地现有的野生资源，筛选出优良的抗寒草坪草种质资源，不仅有利于推动北方地区草坪业发展，而且有助于缓解当前中国草坪草种过于依赖进口的现状。

阿拉伯婆婆纳为玄参科婆婆纳属的一年生或越年生草本植物，在中国华北、西北、中南、西南等地区均有分布，常集群生长、成片分布，天然低矮匍匐，具有草坪草的诸多性状且花色为蓝色，具有较高的观赏价值和较强的花色优势。此外，阿拉伯婆婆纳越冬性强，冬季不存在枯黄期，最冷月只是叶色有些发红，返青也早于常见的冷季型草坪植物红花酢浆草(OxaliscorymbosaDC.)、白三叶(Trifoliumrepens)、早熟禾(PoaannuaL.)，早春2月即开始开花，3月初为盛花期，绿期、花期优势均非常明显[2]，是一种极具发展潜力的观赏性冷季型草坪草资源。但是，目前只有杨文权等[3]对其草坪用性状进行了初步研究，提出阿拉伯婆婆纳具有绿期长、盖度大、人工移栽成活率高、水平生长速度快等坪用草的优点；张庆良等[4]研究了其园林应用，尝试将阿拉伯婆婆纳引入冬春季花坛而取得良好效果。而关于阿拉伯婆婆纳抗寒生理特性的研究尚未见报道。

白三叶为豆科三叶草属多年生冷季型草坪草，具有较强的抗旱、抗寒、耐盐碱等特点[5]，现已广泛用于中国北方地区草坪绿化工程中[6]。因野生白三叶和阿拉伯婆婆纳具有相似的生活型和物候期，且已成功引种栽培并大面积推广，故研究了2种植物自然降温过程中生理反应方面对低温胁迫响应的不同，以揭示阿拉伯婆婆纳适应低温胁迫的生理机制，为其开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与样地概况

试验材料为阿拉伯婆婆纳和野生白三叶，采于郑州市中牟县河南农业职业学院园艺试验基地内。采样地属暖温带大陆性季风气候，年均气温14.5 ℃，7月份最热，平均气温26.9 ℃；12月到1月为冬季，1月份最冷，平均气温0.3 ℃；极端最低气温-13.8 ℃，极端最高气温44.2 ℃；年平均降雨量632 mm，无霜期220 d；土壤类型为潮土，肥力中等。

1.2 越冬率及返青情况观测

越冬率测定方法：用20 cm×20 cm铁丝样方随机测定2种植物入冬前及返青后的覆盖度，后者与前者的比值即为越冬率。返青期参照张跃进等[7]的标准，结合2种植物的实际越冬情况，以80%的植株变绿为准。

1.3 取样与生理指标测定

从连续5 d平均温度低于5 ℃开始，到叶片出现冻害症状为止，每隔10 d取样一次，具体时间分别为2018-12-14,2018-12-24,2019-01-03，每次在13:00―14:00取样。每次取样记录前3 d日最高和最低气温，计算出前3 d的平均最高和最低气温。

取样时选取2种植物生长比较一致的3块不同地段，即3个重复。每次取样均选取植株中部大小一致、无病虫害的功能叶片，以尽量保证试验材料生理特性的一致性。取完样后，放入液氮罐迅速冷冻，回实验室后放至-80 ℃冰箱保存，用于生理指标的测定。

测定指标包括叶片的超氧化物歧化酶(SOD)活性、游离脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量。SOD活性采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法测定，以抑制NBT光化还原50%为一个酶活单位。Pro含量采用茚三酮溶液显色法测定，MDA含量用硫代巴比妥酸(TBA)反应法测定[8]。

1.4 数据处理与分析

试验数据利用Excel 2007制作图表，用单因素方差分析和Duncan法多重比较对同一植物不同时间以及同一时间不同植物间生理指标的差异进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 取样期间采样地气温变化

取样期间采样地气温变化见表1。由表1可以看出，在2018-12-14―2019 -01-03取样期间，日最低气温及前3 d平均最高气温持续下降明显，取样当日平均温度均低于1 ℃，2019-01-03第3次取样时，前3 d平均最高气温、前3 d平均最低气温及当日最低气温均比上一次取样时显著下降。

2.2 2种植物越冬覆盖度、越冬率及返青期比较

如表2所示，越冬前，2种植物的覆盖度差异不显著，越冬后阿拉伯婆婆纳的覆盖度及越冬率均极显著高于白三叶(P<0.01)，说明阿拉伯婆婆纳受冻害较轻，越冬性好。以80%的植株变绿为标准，阿拉伯婆婆纳2019年2月初已返青，早于白三叶1个多月，而且在2019年2月初已开始现花。

表1 取样期间试验地气温变化Table 1 Temperature variation in experimental field during sampling ℃

表2 2种植物越冬覆盖度、越冬率及返青期比较Table 2 Comparison of winter coverage,overwinter rate and regreening stag of two plants

注:**表示在0.01水平上差异显著。

Note: **indicates the significant difference at 0.01 level.

2.3 自然降温对2种植物叶片中SOD活性的影响

在冬季自然降温过程中，阿拉伯婆婆纳和白三叶SOD活性的总体变化均呈下降趋势(图1)。阿拉伯婆婆纳的SOD活性每次取样测定时均高于白三叶，在2018-12-24第2次测定时，两者之间的差异达到了显著水平(P<0.05)，其他2次测定时2种植物SOD活性差异不显著。同一植物不同测定时间SOD活性的差异显著性检验结果表明，从2018-12-14到2018-12-24，阿拉伯婆婆纳和白三叶的SOD活性均存在显著性下降(P<0.05)，阿拉伯婆婆纳的降幅为13.1%，白三叶的降幅为17.3%；从2018-12-24到2019-01-03，2种植物的SOD活性仍有下降，但差异不显著(P>0.05)。

2.4 自然降温对2种植物叶片中脯氨酸含量的影响

如图2所示，在冬季自然降温过程中，2种植物脯氨酸含量的总体变化趋势不太一致。白三叶的脯氨酸呈缓慢上升趋势，第2次测定与第1次测定相比几乎没有变化，增幅仅为2.5%，到第3次测定时才有明显上升，3次不同测定时间之间脯氨酸含量差异不显著；阿拉伯婆婆纳叶片中的脯氨酸含量从第1次测定到第2次测定时显著上升(P<0.05)，增幅达27.5%，到第3次测定时脯氨酸含量变化不明显，略有下降，但仍然显著高于第1次测定值。冬季3次不同测定时间，阿拉伯婆婆纳叶片的脯氨酸含量均高于白三叶，在2018-12-24第2次测定时，二者脯氨酸含量差异较大，接近显著水平(P=0.07)，另外2次测定时差异不显著。

注：同一曲线标有不同小写字母表示不同取样时间在0.05水平上差异显著；*表示同一取样时间2种植物间差异显著(P<0.05)，未标者表示差异不显著。下同。

2.5 自然降温对2种植物叶片中丙二醛含量的影响

在冬季自然降温过程中，阿拉伯婆婆纳和白三叶叶片MDA含量呈现相似的变化趋势(图3)，即从2018-12-14到2018-12-24，MDA含量均有小幅上升，阿拉伯婆婆纳的增幅为12.5%，白三叶的增幅为29.7%；从2018-12-24到2019-01-03，两者MDA含量均有微幅下降，但变化不明显。第3次取样测定时3个生理指标的变化均不明显，这可能与第3次取样时日平均气温降幅减小有关。阿拉伯婆婆纳的MDA含量在3次取样测定时，始终低于白三叶，但二者之间的差异不显著。同一植物不同测定时间MDA含量差异显著性检验结果表明，2种植物的3次测定结果之间均不存在显著性差异(P>0.05)。

图2 自然降温过程中2种植物叶片中Pro含量的变化

图3 自然降温过程中2种植物叶片中MDA含量的变化

3 结论与讨论

植物抗寒性与体内保护酶活性密切相关，保护酶活性高，说明植物对环境反应快，抗氧化能力强，抗寒性也强[9]。SOD是保护酶系统的核心成员，在植物的抗寒锻炼过程中起着重要的保护作用。本研究中，3次取样测定时，阿拉伯婆婆纳叶片的SOD活性始终高于白三叶，在第2次取样测定时，2种植物SOD活性的差异达到显著水平，表明阿拉伯婆婆纳活性氧清除能力强于白三叶，能有效保护细胞膜系统免受低温伤害。冬季自然降温过程中，2种植物叶片中SOD活性的总体变化均呈下降趋势，但耐寒力强的阿拉伯婆婆纳SOD活性降幅小于耐寒力稍弱的白三叶。这与王榕楷等[10]对3种草坪草的耐寒性与超氧化物歧化酶作用关系的研究结果一致，但与何丽斯等[11]对茉莉耐寒能力研究的结果不太一致。茉莉叶片SOD活性在自然降温过程中呈先升后降趋势，而本研究中2种植物SOD活性一直呈下降趋势。结果不一致的原因可能是因为本试验的取样时间是在最冷月，气温已降至全年最低点，第2次取样时日最低气温已达到-6 ℃，第3次取样时日最低气温已达到-8 ℃，此时低温胁迫强度比较大，SOD本身可能也受到一定程度的损害，因而活性一直呈下降趋势。

植物体内游离脯氨酸作为细胞质的渗透调节物质，在低温胁迫下可以诱导合成，以增加细胞液浓度，降低细胞液冰点，防止细胞质凝固和过度失水，保护细胞免受低温伤害[12]。刘南清等[13]对假俭草叶片渗透调节物质含量与低温伤害关系的研究表明，脯氨酸是假俭草细胞内与抗寒性相关的重要渗透调节物质之一，假俭草叶片内的脯氨酸可以作为假俭草耐寒性评价的重要指标。但也有研究表明，逆境下脯氨酸的积累是伤害反应，与抗性无关[14]。本研究中，阿拉伯婆婆纳叶片的脯氨酸含量在每次取样测定时均高于白三叶，且阿拉伯婆婆纳脯氨酸含量在第2次取样测定时已显著上升，而白三叶第3次测定时才有明显上升。结合越冬率观测，以及其他生理指标反映的结果，本试验中脯氨酸含量应为抗性指标，说明遭受低温胁迫时，阿拉伯婆婆纳比白三叶更能快速反应，通过自身调节增加脯氨酸的积累，维持较强的渗透调节作用，以提高其抗寒能力。

MDA是膜脂过氧化作用的终产物，其含量高低常用来衡量植物在逆境胁迫中受活性氧伤害的程度。低温逆境下，MDA积累越多，膜脂过氧化程度越高，说明膜受伤害越严重，植物抗寒性越弱[15]。本研究结果显示，阿拉伯婆婆纳和白三叶叶片MDA含量从第1次取样测定到第2次取样测定时均有上升，但阿拉伯婆婆纳的增幅明显小于白三叶，而且3次测定时，阿拉伯婆婆纳叶片MDA含量始终小于白三叶，说明阿拉伯婆婆纳膜脂过氧化程度相对较轻，受低温伤害的程度小于白三叶。

综上所述，在冬季自然降温过程中，阿拉伯婆婆纳SOD诱导合成能力较强，游离脯氨酸快速积累，MDA含量小幅上升。3项生理指标表现出较为一致的结果，即阿拉伯婆婆更能快速反应，通过自身生理调节以适应低温胁迫。2种植物越冬及返青情况观测结果也表明，阿拉伯婆婆纳越冬率极显著高于白三叶，最冷月冻伤叶片明显少于白三叶，且早春返青早于白三叶35 d，自然越冬表现与生理指标反映的结果一致，均表明阿拉伯婆婆纳对低温的耐受性比白三叶更强。因此，可以考虑将阿拉伯婆婆纳作为冷季型草坪草在中国华北、西北地区引种栽培，以弥补该地区当前草坪草种多存在冬季枯黄期较长、无绿可赏的不足。