四指马鲅泌尿系统胚后发育组织学研究

蓝军南，李俊伟，区又君，温久福，李加儿，李 活，周 慧

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广州 510300；2.上海海洋大学，水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，水产科学国家级实验教学示范中心，海洋动物系统分类与进化上海高校重点实验室，上海 201306；3.茂名市金阳热带海珍养殖有限公司，广东茂名 525444）

脊椎动物泌尿系统的主要器官是肾脏，其功能单位可以清除代谢废物，维持体液渗透压平衡，称为肾单位，其中的肾小球与血管系统相结合，起血液滤过作用［1］。在哺乳动物中，胚胎发生过程中有3种逐渐复杂的肾脏结构（前肾、中肾和后肾），而鱼类只有前肾和中肾发育［2-3］。前肾是脊椎动物首先形成的泌尿器官，随后中肾才开始发育形成［4］。前肾在鱼类自由游动的胚胎中起着渗透调节作用，其功能齐全对存活至关重要［2］。研究表明，斑马鱼（Barchydanioreriovar.）在10 dpf（days post fertilization）从仔稚鱼向幼鱼过渡，这涉及到许多器官和组织的变化，包括鳞片和鳍的形成，性腺、肠道和神经系统的重塑，中肾同样在这一时期出现，是为了应对体质量增加带来的更高的渗透调节需求［5-7］。中肾的发生和发育遵循一种立体的典型模式：间充质细胞团上皮化形成肾小泡并与集合管相接合，并通过S形小体期延长发育成一个新的肾单位［8］。近年来中国学者对淡水鱼类的泌尿系统研究较多，如南方鲶（Silurusmeridionalis）［9］、西藏墨头鱼（Garrakempihora）［10］、贝氏高原鳅（Triplophysa bleekeri）［11］、红唇薄鳅（Leptobotiarubrilaris）［12］、大鳞副泥鳅（Paramisgurnusdabryanus）［13］等，而海水鱼类仅卵形鲳鲹（Trachinotusovatus）［14］等少数鱼类有相关报道。研究鱼类肾脏乃至泌尿系统组织结构及发育对了解其排泄与渗透压调节具有重要意义。

四指马鲅（Eleutheronematetradactylum）隶属于鲻形目，马鲅亚目，马鲅科，四指马鲅属，俗称马友、午鱼、午笋等，广泛分布于热带和温带海区，主要分布于印度洋和太平洋西部，在中国南海、东海、渤海、黄海均有分布［15-17］。其肉质鲜美，营养价值高，养殖前景广阔。2012—2015年区又君等［18］对四指马鲅进行规模化全人工繁育取得成功，并在粤、桂、闽、琼、浙等沿海地区推广养殖，现已成为海水鱼类养殖的新品种。近年来对四指马鲅的研究主要在胚胎发育、仔稚鱼发育、消化系统发育、视网膜发育及环境胁迫等方面［19-24］，然而其泌尿系统胚后发育的相关研究在国内外尚未见报道。本文应用石蜡组织连续切片和H-E染色技术对人工培育的四指马鲅泌尿系统胚后发育进行研究，了解其组织形态发育及其结构特征，以丰富四指马鲅的基础生物学资料，为阐明四指马鲅的排泄及渗透压调节特点提供理论依据，从而为苗种培育和淡化养殖提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用的四指马鲅鱼苗为2018年6—9月课题组在南海水产研究所珠海试验基地培育所得。

1.2 实验方法

鱼苗孵化及培育参考区又君等［18］的方法进行。在2 dph（days post hatching）将鱼苗置于1 000 L白色塑料桶中培育，放苗前水桶中预先接种小球藻和轮虫，每天添加淡水降低盐度0.5～1，直到盐度降至9.0±0.5，该盐度为后期淡化养殖盐度。培育水温（28±2）℃。7 dph投喂枝角类和桡足类幼体，25 dph投喂卤虫无节幼体，30 dph投喂粉状配合饲料并逐渐过渡到投喂人工颗粒饲料。1～18 dph，每天取样一次，每次取15尾；20～50 dph，每5 d取样一次，每次取15尾。取样时记录鱼苗日龄并用数显游标卡尺（精确度0.01 mm）测量全长，置于4%多聚甲醛通用型组织固定液（BL539A）中固定24 h后转入70%的乙醇中保存。将固定好的样品进行流水冲洗12 h，经50%～100%梯度乙醇脱水（50%乙醇2 h、70%乙醇 4 h、80%乙醇 2 h、85%乙醇 2 h、95%乙醇45 min×2、100%乙醇45 min×2），二甲苯透明（无水乙醇和二甲苯体积各占1/2的混合液1 h、二甲苯15 min×2），浸蜡（石蜡2 h×2），石蜡包埋，以4～6μm的厚度进行纵向和横向连续切片，苏木精-伊红（haematoxylin-eosin，HE）染色，中性树脂封片。制片后用ZEISS Axio Scope.A1型光学显微镜观察并摄影记录。

2 结果与分析

2.1 前肾

3 dph，可观察到原肾管前端发生扭曲，是为前肾区域，3～4个前肾小管分散排列，管壁为立方上皮，细胞排列疏松，呈粉红色，管径较小，管间分布有少量着色较深的未分化干细胞（图版Ⅰ-1）。7 dph，前肾左上方有淋巴样组织形成，前肾小管数量增多，管径增大，管壁细胞增厚，细胞界限不清晰，管腔上皮的游离面出现淡红色刷状缘，前肾小管间有较多的红细胞填充（图版Ⅰ-2）。15 dph，前肾后端及脊索腹面有较多的黑色素-巨噬细胞中心出现，淋巴组织往前肾小管周围填充，管径继续增大，管壁细胞界限较清晰，核深染，发育中的前肾小管周围有较多的红细胞分布（图版Ⅰ-3）。18 dph，前肾淋巴组织增多，淋巴类细胞填充小管间隙（图版Ⅰ-4）。20 dph，前肾主要由淋巴组织和前肾小管组成，此时少数前肾小管开始模糊退化，表明泌尿机能开始衰退（图版Ⅰ-5）。30 dph，大量的前肾小管出现结构模糊或溶解的现象，部分前肾小管已经退化，淋巴组织向内填充（图版Ⅰ-6）。未观察到前肾在发育过程中有肾小球等肾单位结构形成，在前肾小管退化之前主要由前肾小管行使泌尿功能。

2.2 中肾

4 dph，中肾区域仅观察到原肾管，结构简单，周围尚未有嗜碱性细胞等出现（图版Ⅱ-1）。7～16 dph，中肾导管管壁细胞增厚，嗜碱性增强，细胞核深染，呈紫红色；紧贴中肾导管由头至尾先后出现若干嗜碱性致密的肾小管原基；导管背侧红细胞出现并逐渐增多；间充质细胞零星分布；导管腹侧出现较多的黑色素-巨噬细胞团（图版Ⅱ-2）。20 dph，中肾前端已有3～5个肾小管形成，管壁细胞排列疏松，嗜碱性强，紫红色，管间有较多的间充质细胞分布；肾小管末端有嗜碱性细胞团聚集，形成内生的细胞团，为早期肾小体；周围有较多黑色素-巨噬细胞团分布（图版Ⅱ-3）。25 dph，中肾后端也开始出现早期肾小体；肾小管背侧有嗜碱性细胞团分布，类似生中肾细胞团，或将分化成次级肾小管；肾小管芽垂直于中肾管向背侧延伸弯曲，细胞高柱状（图版Ⅱ-4）。30 dph，中肾背侧淋巴组织形成并向内延伸；可观察到亚成熟的肾小体，其肾小球增大，细胞嗜碱性减弱，核质比减小，肾小囊与肾小球的间隙变小；肾小管数量明显增多，基本布满肾体；肾小管管壁细胞嗜碱性减弱，核质比减小，呈红色；近端小管与远端小管开始有区分，近端小管管壁细胞其核多呈低柱状或梭形，细胞紧密排列，管腔面具有浓密的强嗜伊红的刷状缘将管腔闭锁；远端小管管壁细胞其核多呈椭圆形，管腔面的纤毛已逐渐减少或已消失（图版Ⅱ-5）；另外，远端小管与集合管的结合处开始贯通，且周围有较多红细胞分布（图版Ⅱ-6）。40 dph，中肾淋巴组织增多，从周围慢慢向内部填充；肾小管数量继续增多，小管间有较多的淋巴类细胞分布；肾小体数量有所增加，开始在中肾内部发育（图版Ⅱ-7）。45 dph，肾小管数量继续增加，其管壁细胞增厚，着色加深，小管间有较多的血窦分布，红细胞聚集（图版Ⅱ-8）；第一近端小管和第二近端小管开始区分，第一近端小管细胞高柱状，嗜碱性较强，核质比高，细胞界限不清楚，腔面具较厚的刷状缘；第二近端小管细胞柱状，嗜碱性较弱，核质比较低，细胞界限较清晰，腔面刷状缘较矮；二者与远端小管对比明显，管间由淋巴类细胞填充，分布有较多黑色素-巨噬细胞中心（图版Ⅱ-9）。50 dph，淋巴组织及红细胞充满肾小管间隙（图版Ⅱ-10）；肾小管管壁增厚，管径增大；早期肾小体、亚成熟肾小体以及成熟肾小体分布于中肾边缘或内部，总数量并不多；第一近端小管、第二近端小管及远端小管区分明显，未观察到第一远端小管和第二远端小管区分（图版Ⅱ-11，12），此时中肾组织结构与成鱼相接近。

2.3 输尿管和膀胱

4～7 dph，中肾区域仅观察到原肾管，肾管逐渐增大，管壁细胞增高，未观察到膀胱形成（图版Ⅲ-1）。8～9 dph，肾管后端膨大形成原始膀胱，仅由1～2层细胞组成，是为典型的输尿管膀胱（图版Ⅲ-2）。18 dph，中肾管管壁增厚，外层有结缔组织薄膜包裹，可称输尿管；膀胱紧贴后肠，内腔增大，膀胱壁增厚，黏膜层形成，向腔面伸长（图版Ⅲ-3）。30 dph，输尿管管壁继续增厚；膀胱壁由黏膜层、肌肉层和浆膜层组成，黏膜层为变移上皮，肌肉层明显，浆膜层为结缔组织（图版Ⅲ-4）。50 dph，中肾后端可观察到两输尿管并行后合二为一，后接膨大的膀胱。此时输尿管管壁增厚，由2～3层立方上皮组成，肌肉层不明显，浆膜层较厚，中间有小血管分布（图版Ⅲ-5）。膀胱壁仍由黏膜层、肌肉层及浆膜层组成，各层均有明显增厚（图版Ⅲ-6）。

观察发现，出膜早期仔稚鱼主要以前肾行使泌尿机能，前肾管充当输尿管；当前肾衰退，中肾形成后则以中肾管为输尿管，始于中肾后端，并行向后合并膨大为典型的输尿管膀胱。

3 讨论

鱼类新陈代谢产生的代谢废物，特别是含氮化合物及各种盐离子主要由泌尿系统排出体外，它是鱼类维持生命活动不可或缺的重要系统。硬骨鱼类泌尿系统主要包括前肾（胚胎及仔稚鱼时期）、中肾及输导管。肾脏是鱼类泌尿系统的主要组成部分，具有维持水盐平衡、造血、免疫以及分泌作用，是一个结构复杂、功能多样的器官。四指马鲅的肾脏发育分前肾和中肾两个阶段，与贝氏高原鳅、大鳞副泥鳅等大多数硬骨鱼类基本一致［11，13］。四指马鲅在3 dph观察到前肾小管已经形成，中间有未分化的干细胞分布，后经发育前肾小管增大，数量增多，干细胞分化形成各类型细胞及淋巴组织，表明其在胚胎时期及胚后早期前肾行使泌尿机能，这与南方鲶、卵形鲳鲹等多数鱼类基本类似［14，25］。7 dph前肾小管腔面出现游离纤毛，表明前肾小管的泌尿机能有所增强。仔稚鱼在发育过程中未观察到前肾有肾小体或血管球等结构形成，表明四指马鲅在发育初期代谢废物主要经前肾管排出体外，故滤尿效能低下。然而鲶鱼（Silurusasotus）和南方鲶在2 dph就形成前肾小体［25-26］，贝氏高原鳅在6～8 dph开始形成前肾小体［11］，可见淡水鱼类前肾的泌尿机能在发育早期比海水鱼类更高效，温龙岚等［11］认为可能是由于生长环境不同所致。四指马鲅在20 dph前肾小管开始退化，不同的鱼类其前肾管退化的时间差别较大，如卵形鲳鲹在14～15 dph 就 已 经 开 始 退 化［27］， 草 鱼（Ctenopharyngodonidellus）在 17 dph开始退化［28］，鳜 （Sinipercachuatsi）在 22 dph开始退化［29］，斜带石斑鱼（Epinepheluscoioides）则在 50 dph才开始退化［30］，前肾小管的退化和减少表明前肾开始由泌尿器官向免疫器官转变，此时泌尿功能开始减弱，中肾逐渐行使泌尿功能。

鱼类的中肾发育主要研究肾单位的发育过程，早在1991年 HENTSCHEL等［31］将软骨鱼类点纹斑竹鲨（Chiloscylliumpunctatum）亚成体的肾单位发育划分为肾原基期、S形小体期、发育期和幼稚期4个阶段；岳兴建等［9］将南方鲶中肾发生发育过程分为间充质细胞聚集、中肾小泡出现、肾小管芽形成、肾小体发生、初级肾单位形成、初级肾单位成熟及第二、三级肾单位发生等时期，把中肾肾单位的发育分为分化前期、分化期、发育期、成熟期4个时期；而温龙岚等［11］将贝氏高原鳅中肾单位的发生分为肾小管原基、肾小管芽、幼稚肾单位和亚成熟肾单位4个阶段。肾小管在不同的时间点分化出功能上不同的节段，近端分为近曲小管（第一近端小管）和近直小管（第二近端小管）两段，远端分为远端早期（第一远端小管）和远端晚期（第二远端）两段［32］。本研究发现，7～16 dph，四指马鲅中肾区由前至后先后形成肾小管原基；20～25 dph肾小管芽和早期肾小体（幼稚肾单位）形成；30 dph亚成熟肾小体形成，近端小管和远端小管开始区分；45～50 dph，第一近端小管与第二近端小管开始区分，成熟肾小体开始形成。因而把四指马鲅肾单位的发育分成肾小管原基、肾小管芽、早期肾单位、亚成熟肾单位、成熟肾单位等5个阶段。与淡水鱼类相比，四指马鲅肾小体数量较少，主要分布在中肾边缘区域。淡水鱼处于低渗环境，主要通过肾脏将过多的水分排出体外，所以肾小体发达，排尿量也比较多；而四指马鲅属海水鱼类，生活于高渗环境，需要不断补水，必须减少排尿保留水分，因而肾小体数量较少［33］。直至50 dph，四指马鲅中肾小管分化为第一近端小管、第二近端小管、远端小管以及集合管4部分，尚未区分颈段、第一远端小管和第二远端小管等，与卵形鲳鲹、南方鲶、大鳞副泥鳅、西藏墨头鱼等结果类似［9-10，13-14］。该部位或本已缺失，需对成体中肾进行观察验证。此外，四指马鲅中肾在发育过程中可观察到较多的黑色素-巨噬细胞中心、淋巴细胞和红细胞，因此推测四指马鲅发育早期中肾兼具造血、免疫、渗透压调节以及泌尿功能。

肾脏过滤的新陈代谢废物由肾小管汇集到输尿管，从而贮藏于膨大的膀胱便于排出体外。研究结果表明，四指马鲅在出膜后早期，仔稚鱼主要以前肾行使泌尿机能，前肾管充当输尿管将废物排出体外，膀胱尚未形成；当前肾衰退，中肾形成后则以中肾管为输尿管，符合一般硬骨鱼类的发育规律［33］。中肾管沿肾脏腹面偏两侧下行，沿途有集合管汇入，输尿管始于肾脏后端，并行向后合并膨大为膀胱，属典型的输尿管膀胱，与红唇薄鳅等大多数硬骨鱼类一致［12］。输尿管在发育过程中管壁和外被的结缔组织不断增厚，至50 dph肌肉层仍不明显，仅由立方上皮和结缔组织组成。膀胱壁先是一层上皮组织，后发育出黏膜层和浆膜层，至30 dph肌肉层明显，往后各层均逐渐增厚。四指马鲅膀胱的组织结构与多数鱼类一致，其发达程度较高，膀胱内腔比短体副鳅（Paracobitispotanini）等淡水鱼类要大，黏膜层变移上皮较明显，表明其具有较强的重吸收能力［34］。

综上所述，鱼类泌尿系统的发育与其生长环境及生活习性相适应。本研究仅阐述了四指马鲅泌尿系统发育的一般规律，亟待进一步研究不同环境条件对四指马鲅泌尿系统排泄及渗透压调节功能的影响，以揭示养殖过程中病态多发的原因是否与之有关，这对指导苗种培育、淡化驯养及工厂化健康养殖具有重要意义。

图版Ⅰ 四指马鲅前肾胚后发育PlateⅠ The postembryonic development of pronephros in E.tetradactylum

图版Ⅱ 四指马鲅中肾胚后发育PlateⅡ The postembryonic development of mesonephros in E.tetradactylum

图版Ⅲ 四指马鲅输尿管和膀胱胚后发育Plate 3 The postembryonic development of ureter and urinary bladder in E.tetradactylum