重组GSTA3 蛋白对福美双诱导的TD 肉鸡生长性能的影响

杨世雄，李 桢，郭 敏，宁官保，张 鼎，田文霞

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.晋城市科学技术局，山西晋城048000）

肉鸡胫骨软骨发育不良（Tibial Dyschondroplasia，TD）常发生于快速生长的肉鸡中，是一种严重的骨骼性疾病，在1965 年被LEACH 等[1]发现。TD的发病机制比较复杂，致病机理尚没有被研究者研究清楚。

福美双别名秋兰姆，是一种广泛应用于植物杀菌的低毒杀菌剂，此外也可作为橡胶生产中的促进剂。有研究表明，饲料中添加福美双，可大面积诱发TD[2]。田文霞等[3-5]也使用福美双成功诱发TD，发病率高达94.44%，明显优于其他因素，经过深入分析病鸡的生长性能、病理组织变化等，发现与自然发病基本一致，可以作为理想的TD 模型，为TD 机理研究提供了稳定、可靠的病理模型。

谷胱甘肽硫转移酶（Glutathione S-Transferase，GSTs）是1 个超家族，广泛存在于各种植物动物微生物体内，是主要的II 期解毒酶，在防御各种环境毒物和氧化应激中起着核心作用，可以催化多种化学物质与谷胱甘肽巯基结合，使其易于排泄，以达到将有毒物质排出体外的目的。田文霞等[6]采用基因芯片技术分析各种相关基因在TD 肉鸡胫骨中的表达，发现在肉鸡发生TD 时，GSTA3 基因显著表达，在使用福美双构建的TD 模型中，GSTA3 在第1 天表达上调，第2 天和第4 天表达下调。同时发现在TD 发生时，有类固醇的参与，而该家族是人类已知的催化效率最高的类固醇异构酶，GSTA3 是该家族成员之一，GSTA3 在类固醇生成组织中选择性表达，在类固醇类激素的合成中起到了重要作用[7-10]。这提示在TD 发生时，GSTA3 可能会起到重要的作用。

本研究利用福美双构建肉鸡TD 模型，之后分别用低剂量的GSTA3 蛋白和高剂量的GSTA3 蛋白对TD 肉鸡腿部肌肉进行注射，定期称取肉鸡质量，探究其对肉鸡生长性能的影响，旨在为后续肉鸡TD 的有效治疗提供一定的基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试120 羽1 日龄艾维茵肉鸡购于山西省大象农牧集团有限公司；福美双购自美国life 公司；PBS 缓冲液购自北京索莱宝公司；表达重组GSTA3蛋白的大肠杆菌由山西农业大学动物科技学院生物制品实验室保存。

1.2 重组GSTA3 蛋白的表达纯化

将GSTA3 大肠杆菌接种于LB 固体培养基（加卡那霉素），置于37 ℃培养箱中培养12～14 h，挑取单菌落接种于100 mL 液体LB 培养基（加卡那霉素）中，置于摇床中14 h，转接到大瓶液体LB 培养基（加卡那霉素）中培养，2～3 h 后，OD600达到0.4～0.7 时加入IPTG 诱导21 h，然后4 ℃离心洗菌，于冰上超声破碎细菌，菌液以达到透亮为标准，用0.45 μm 滤器过滤，4 ℃保存。利用镍柱亲和层析方法纯化蛋白，之后透析，浓缩，使用BCA 试剂盒测定重组GSTA3 蛋白的浓度，待用。

1.3 试验设计

试验于2017 年7 月开始，在山西农业大学动物科技学院实验基地进行。艾维茵肉鸡按照常规方法饲养管理7 d 后分组，每组20 只肉鸡，共分6 组，分别为A 组（对照组）.饲喂基础日粮，注射4 次PBS；B组.饲喂基础日粮，注射4 次GSTA3 蛋白（20 μg/kg）；C组.饲喂基础日粮，注射4 次GSTA3 蛋白（50μg/kg）；D 组.在基础日粮中添加福美双（100 mg/kg），注射4 次PBS；E 组.在基础日粮中添加福美双（100mg/kg），注射4 次GSTA3 蛋白（20 μg/kg）；F 组.在基础日粮中添加福美双（100 mg/kg），注射4 次GSTA3 蛋白（50 μg/kg）。按照文献[5]和文献[11]的试验设计，利用福美双诱导TD，在第8、9 日龄分别添加福美双日粮，之后换成正常基础日粮，分别在第8、10、12、14 日龄注射重组GSTA3 蛋白或PBS，注射部位均为腿部肌肉。在第12、14、18、23 日龄每组随机取5 只，称取质量，计算其平均增质量。

1.4 数据分析

使用SPSS 23.0 软件进行数据分析与处理。

2 结果与分析

2.1 GSTA3 蛋白对肉鸡增质量的影响

从表1 可以看出，在12～14 日龄，D、E、F 组的鸡只增质量显著低于A、B、C 组，表明TD 严重影响了肉鸡的增质量；在14～18 日龄和18～23 日龄，F组与A、B、C 组的鸡只增质量无显著差异，说明GSTA3 蛋白对TD 肉鸡的增质量恢复有较好的作用，且有剂量依赖性。每个时段C 组与A、B 组都无显著差异，表明GSTA3 蛋白对正常肉鸡的增质量没有影响。

表1 体质量变化平均值 g/只

2.2 GSTA3 蛋白对肉鸡症状表现的影响

在试验中发现，10 日龄的TD 组临床症状较为明显，小鸡精神萎靡，久卧不愿走动，站立不稳。12 日龄TD 组症状加剧，大部分小鸡精神差，跛行，胫骨关节处肿大，运动困难，劈叉。14 日龄和12 日龄症状相似，TD 肉鸡进食较少，增质量明显低于对照组。从14～18 日龄，能明显发现，注射了高剂量蛋白的TD 肉鸡精神逐渐恢复，大部分鸡逐渐能够走动进食，增质量也明显增加，与对照组已无差异。从18～23 日龄，注射了低剂量和高剂量蛋白的TD 肉鸡精神已经恢复，大部分鸡已经恢复正常采食，增质量也恢复到与对照组无差异，且从数据上看，注射了高剂量蛋白的组比低剂量的组增质量更明显，说明蛋白对生长有一定的促进作用。

3 结论与讨论

肉鸡胫骨软骨发育不良（Tibial Dyschondroplasia，TD）常发生于快速生长的肉禽。该病会导致肉鸡生长缓慢，运动困难，进而导致肉品质的下降，同时也会带来动物福利问题。该病导致禽类胫骨关节肿大，跛行，精神沉郁，由于运动受限导致采食，饮水困难，生长性能降低[12]。症状严重的常见久卧不起，精神极差，导致肉品质和产量下降。

谷胱甘肽硫转移酶是参与机体解毒的一个关键酶。其可以催化各种有毒化学物质，缓解其毒性，如杀虫剂、药物、重金属等外源化合物、脂质过氧化产物、4-羟基壬烯酸（4HNE）和丙烯醛等内源化合物[13-16]。GSTA3 是GSTs 超家族中的一个成员，目前对于GSTA3 的研究报道还很少，在人类的cDNA 文库中发现了该基因，表明GSTA3 可能在一些特殊的发育调控中起一定的作用[17]。刘红霞[18]在福美双诱导构建的TD 肉鸡模型中，使用cDNA 芯片技术发现GSTA3 可能参与代谢细胞色素P450，清除毒性物质。其他研究也发现，福美双会影响肝脏导致其解毒功能降低[19]，且福美双导致的细胞凋亡与异常的谷胱甘肽代谢有显著关联，而GSTs 可以调节该异常反应，维持机体的正常解毒[20]。

目前，GSTA3 在肉鸡TD 发生过程中的作用研究还很少，本试验证明了重组GSTA3 蛋白对TD 肉鸡增质量有恢复作用。本试验未从其他方面评估其生长性能的恢复，以后应进一步从饲料转化率、免疫器官质量等方面评估其生长性能。