濒危植物水青树叶表型性状多样性分析

段 帆，李 珊，甘小洪

(西南野生动植物资源保护教育部重点实验室／西华师范大学生命科学学院，四川 南充 637009)

水青 树(Tetracentron sinense) 为 水 青 树科 (Tetracentraceae)水青树属仅有的高大落叶乔木，第三纪孑遗植物，主要分布于西南及华中地区海拔900～3500 m 的深山、峡谷、陡坡悬崖处。由于后期人为干扰严重，地质环境的变迁外加适宜其生存的环境较险峻等原因，水青树居群和数量不断减少，生存范围逐渐狭隘，1999 年被列为国家Ⅱ级重点保护濒危植物[1]。水青树木材无导管，对研究被子植物的起源与系统进化有重要的科学价值。近年来，我们对水青树生活史的关键环节开展了大量研究，从孢子发生、传粉过程[2]、种子散播[3]、种子萌发和幼苗建成[4—9]等角度探讨了水青树的濒危机制及保护对策。

表型多样性是研究遗传多样性的重要指标，综合了环境因子与遗传因子的外部表现形式，可直观反映变异规律与均匀度，是对环境变化响应最直接的指标。对表型多样性研究有助于了解物种的稳定性及其进化的潜力[10]。相关性分析与主成分分析是表型多样性分析的重要方法，在探讨濒危植物青檀(Pteroceltis tatarinowii)[11]、 云 南 黄 连(Coptis teeta)[12]、野生长柄扁桃(Amygdalus pcdunculata)[13]表型多样性及其进化潜力方面发挥了重要作用。叶是植物进行蒸腾作用和呼吸作用最重要的器官，最能直观表现出植物对环境的响应。迄今，针对水青树的种实性状、叶的表型变异和ISSR 分子标记的遗传多样性已有报道[14—16]。然而，有关水青树叶表型多样性及其与环境的适应性方面还未见报道。该文拟通过对24 个水青树居群中161 株个体的17 个叶表型性状进行多样性分析、相关性分析、主成分分析以及聚类分析，旨在评价其叶表型遗传多样性水平，筛选综合评价最高的种群，以进一步为水青树优质资源的选择、保护与管理提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

水青树叶材料于2015 年5 月采自水青树分布区的24 个自然居群(表1)。采集树冠向阳方向多年生枝条的完整叶片3～4 枚。为避免亲缘关系，每个居群采样时个体之间相距50 m 以上，共收集161 株水青树个体材料。叶片采集后，存放于标本夹中。同时记录居群的位置信息、采集的个体数。

1.2 数据采集与处理

1.2.1 表型性状观测

用EPSON PERFECTION V350 PHOTO 扫描仪将叶片扫描成1:1 的图片，结合水青树叶的实际，参照李珊等[15]的方法，对水青树叶的17 个表型性状指标进行观测。叶形态性状包括叶面积、叶周长、叶柄长、叶长、叶最长、叶宽、叶基尖削、叶先尖削和叶形指数；叶表皮微形态性状包括气孔器长、气孔器宽、上表皮细胞面积、上表皮细胞周长、上表皮细胞弯曲度指数、上表皮细胞密度、气孔器密度。参照韦艳梅等[17]、田青等[18]的方法并改良后，对各性状进行赋值。

1.2.2 数据处理

1.2.2.1 表型遗传多样性

参照Shannon & Weaver与Sawada频率分级与统计原则[16,19]，利用叶表型性状的平均值X、标准差S计算各表型性状分布类型频率以及遗传多样性Shannon-wiener指数(H')。Shannon信息指数计算公式为：H'=-ΣPiln(Pi)(i=1, 2, 3,……,10)。式中，Pi为某性状第i分级内材料分布频率的有效百分比，ln为自然对数。

表1 水青树24 个居群的样品信息Table 1 Sample information of 24 populations of Tetracentron sinense

1.2.2.2 主成分分析和聚类分析

利用SPSS 23.0 软件进行主成分分析和聚类分析。综合因子可对各主成分之间的关系进行调整，利用各主成分的得分乘该主成分公因子方差贡献率，求和，再根据该成分公因子方差贡献率计算各居群综合得分[20]。对17 个叶表型性状进行相关性和聚类分析。为避免不同纲量数据的影响，在对变量的原始数据进行标准化处理(STD)，得到均值为0、方差为1 的正规化数据后再进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 叶表型性状遗传多样性分析

由表2 可知，17 个叶表型性状均存在不同程度的变异。其中叶先尖削(LTPI)变异系数最高(49.23%)，其变化幅度在0.34～4.61 之间；叶宽(LW)的变异系数最低(4.21%)，变化幅度3.48～15.26 cm；17 个性状的变异系数平均值为23.20%。

表3 显示，不同叶表型性状的的Shannon-weiner多样性指数H'值不同，范围在0.82～2.07 之间。叶形态性状H'平均值为1.72，叶表皮微形态H'平均值为1.91，多样性较高(H'＞2)的性状有叶面积(LA)、叶柄长(LPL)与叶最长(LLEST)、上表皮细胞面积(UECA)与上表皮细胞周长(UECP)，总平均值为1.80。

表2 17 个叶表型性状描述性统计分析Table 2 Descriptive statistics analysis of 17 leaf phenotypic traits

表3 17 个性状频率分布(频率/有效比)Table 3 Distribution of 17 traits frequency (frequency/effective percentage)

表4 17 个叶表型形状相关性分析Table 4 Correlation analysis of 17 leaf phenotypic traits

2.2 叶表型性状相关性分析

通过对17个叶表型性状相关性研究发现，有62对呈极显著相关性(P＜0.01)，其中47对性状呈极显著正相关，15对性状呈极显著负相关；有7对呈显著相关(P＜0.05)，其中1对呈显著负相关，6对均呈显著正相关。相关性系数最高的是叶面积(LA)与叶周长(LP)(0.976)，其次为上表皮细胞周长(UECP)与上表皮细胞面积(UECA) (0.966)以及叶全长(LLT)与叶长(LL) (0.948)(表4)。

2.3 主成分分析

对17个叶表型形态性状的原始数据进行主成分分析(表5)，必要性检测KMO值为0.604，可作主成分分析。前三个主成分因子的累计贡献率达83.712%，特征值总和14.23，可靠地代表水青树居群的表型性状频率分布。其中第一主成分中特征值为6.485，贡献率为38.149%，主要有叶面积(LA)、叶周长(LP)、叶宽(LW)，这一类均为叶形态性状；第二主成分特征值为5.447，贡献率为32.039%，主要有上表皮细胞面积(UECA)、上表皮细胞周长(UECP)、上表皮细胞弯曲度指数(UECUI)，这一类为叶表皮微形态性状；第三主成分特征值为2.299，贡献率为13.524%，主要有叶长(LL)、叶基尖削(LBPI)、叶先尖削(LTPI)，为叶形态性状。

表5 水青树17个表型性状主成分分析Table 5 Principle component analysis of 17 leaf phenotypic traits of Tetracentron sinense

根据各项主成分的得分系数，得到如下三个主成分表达式，X1～X17为各变量原始数据进行STD处理后的值。

综合得分表达式为F总=0.381F1+0.320F2+ 0.135F3

利用上式计算各居群的综合得分(表6)，选出综合评价最高的前三名。利用主成分1为X轴，主成分2、3分别为Y、Z轴绘制主成分三维排序图(图1)。结合综合得分与主成分因子三维排序图，可算出主成分1 综合评价前三名的居群分别为白马雪山(BMXS)、虹口(HK)、高黎贡山(GLGS)；主成分2为白河(BH)、佛坪(FP)、唐家河(TJH)；主成分3为神农架(SNJ)、黄柏塬(HBY)、白河(BH)；唐家河(TJH)、虹口(HK)、佛坪(FP)三个居群综合得分最高。

2.4 聚类分析

对17个叶表型变量进行R型聚类分析可以表现各性状的亲疏关系，还可比较变量的代表性。由图2 可知，在以平方欧氏距离15 为阈值时，17 个叶表型性状可分为四类，第一类包括叶面积、叶周长、叶最长、叶长、叶全长、叶宽、叶柄长；第二类包括气孔器长、气孔器宽、上表皮细胞面积、上表皮细胞周长、上表皮细胞弯曲度指数；第三类包括上表皮细胞密度、气孔器密度；第四类包括叶先尖削、叶形指数、叶基尖削。

表6 17个叶表型性状主成分综合得分排序Table 6 Rank of comprehensive score by 17 leaf phenotypic traits

图1 水青树居群PCA 三维排序Fig. 1 Three-dimensional PCA sequence of Tetracentron sinense populations

图2 17个叶表型性状R型聚类分析Fig. 2 R-clustering of 17 leaf phenotypic traits

上表皮细胞面积与上表皮细胞周长(r=0.966)、叶面积与叶周长(r=0.976)以及叶长与叶全长(r=0.685)等3 对性状距离最近，相关性较大，而其他性状相对较分散，故具代表性。因此，去掉叶周长、叶全长、上表皮细胞周长三个性状后对24 个居群进行Q 型聚类分析(图3)。当阈值为15 时，24 个居群可分为3 类。第一类包括大沙河、八大公山、五峰后河、舜皇山、大风顶、雷公山、梵净山、神农架；第二类有高黎贡山、哀牢山、康普、峨眉、白马雪山、黄柏塬等6 个居群；皇冠、白水江、金佛山、虹口、佛坪、唐家河、白河、木林子、七姊妹山、宽阔水等6 个居群被划分在第三类。由表6可看出，除宽阔水与白马雪山，其他22 个居群Q型聚类结果与综合得分排序一致。

图3 24个居群Q型聚类分析Fig. 3 Q-clustering analysis of 24 populations

3 讨论

3.1 表型多样性分析

表型多样性是环境多样性与遗传多样性综合作用的外在表现，既可稳定地遗传也会发生不可逆变异[21]，在植物的进化和适应方面具有重要意义。对研究对象表型性状的选择需要对该性状的代表性进行综合评价。与其他性状相比，叶片是植物进行光合、呼吸以及蒸腾作用的重要器官，对环境因子的响应最明显，可塑性强且有一定的遗传稳定性。因此，叶片可作为分析植物尤其是濒危植物表型多样性的重要指标，对水青树叶表型性状进行多样性分析可评价其遗传多样性。基于此，本文通过对全国24 个水青树居群161 株个体的17 个叶表型性状进行分析。结果表明，表型多样性在不同性状间有较大的差异，进一步对比分析发现，叶面积、叶最长和叶柄长三个表型性状多样性水平最高，Shannon-wiener 多样性指数H'(1.80)较其他濒危植物珙 桐(Davidia involucrate)(2.360)[10]、 格木(Erythrophleum fordii)(2.027)[22]低。对物种的遗传多样性分析有多种方法，如同工酶、分子标记等，不同方法各有其优缺点，同时也具有一致性[23]，结合多种方法对物种遗传多样性进行分析对比可使结果更真实有效。如Li 等[16]利用14 对ISSR 引物对水青树174 个个体进行遗传多样性分析发现，与其他濒危植物相比，水青树物种水平的遗传多样性是很低的。遗传多样性水平是物种遗传变异的体现，说明水青树在物种水平上的变异较低。

3.2 综合评价分析

对变量进行R 聚类可以观察性状之间的亲疏关系，聚类图分支相隔越远的性状相似度越低；相反，聚类最近的性状其相似度最高，也越亲近。通过R变量分析以便有效减少分析变量的个数，选出具代表性的性状进行下一步个体聚类[24—25]，本研究对17个叶表型性状进行R 聚类分析，发现各性状较分散，且性状间的相似性随着平方欧氏距离的减小而增加，当遗传距离阈值为15 时，17 个叶表型性状聚为4 类，其中上表皮细胞面积与上表皮细胞周长、叶面积与叶周长以及叶长与叶全长3 对性状距离最近，相似性最高。该结果为水青树形态性状归类提供重要参考价值，为今后水青树代表性状的筛选打下基础。地理变异是不同地理分布的物种居群之间的差异，这种差异是普遍存在的。根据地理变异规律可分为连续变异、区域板块变异以及随机变异[26]。本研究去除叶周长、叶全长、上表皮细胞周长三个性状后对24 个居群进行Q 型聚类分析，发现各分类级内表型性状分布大致相同，气孔器长、气孔器宽、上表皮细胞面积、上表皮细胞弯曲度指数值较大的10 个居群聚为第一类，气孔器长、气孔器宽性状值较低的6 个居群聚集在第二类，叶形指数较大的8 个居群聚为第三类。第三类聚集于横断山脉以南，与第一、二类相隔；一、二类间有武陵山脉相隔，表现为区域板块变异。分类级内有的居群地理分布较近的聚类在一起，如第一分类级中的白水江、虹口、唐家河、白河，第二分类级中的高黎贡山、哀牢山、康普、白马雪山，第三分类中的大沙河、舜皇山、雷公山、梵净山，表现为地理连续变异，与濒危植物七子花(Heptacodium miconioides)的研究结果类似[27]。同时，同一分类级中也有与其他居群地理相隔较远的居群，比如第二分类级中的峨眉与黄柏塬，第三分类级中的大风顶，说明水青树叶表型具随机变异，与厚朴(Magnolia officinali)种源变异相似[26]。综上，水青树叶表型变异有地理连续变异、区域板块变异以及随机变异三种模式，与李珊等[15]对全国14 个水青树种群的叶表型变异研究结果一致。由于分布区域的不连续，水青树零星地聚集分布，造成水青树的表型遗传变异可能受基因流、遗传漂变以及自然选择等因素影响[28]。

主成分分析是将多个变量降维处理后筛选出少量能代表大部分变量信息的变量的方法[11]，已广泛应用于濒危植物保护研究[24]，但在对水青树研究的应用上处于初步阶段[15]。本研究表明，水青树叶表型性状中前三种主成分累计贡献率达83.71%，能可靠地代表表型性状的频率分布；进一步将主成分分析综合得分结合Q 型聚类方法进行比较，可使聚类分析结果更可靠[28]。表6 中，除了白马雪山与宽阔水两个居群，其他居群主成分分析综合得分排序与Q 型聚类结果一致，综合排名集中的居群在Q 型聚类中也聚为一类，本研究结果可靠。唐家河、虹口、佛坪三个居群综合评价最高，即三个居群的表型能有效代表24 个居群的表型性状多样性。因此在对水青树进行优质种的筛选与保护时可重点围绕这三个地区的野生水青树居群进行。