反相高效液相色谱法测定荠菜中的维生素C

吴海燕 ，张新宇，陈建军，唐明霞，邱卫池，程玉静，袁春新*

（1.南通科技职业学院，江苏南通 226007；2.南通市农村专业技术协会，江苏南通 226006；3.南通市市场监督管理局，江苏南通 226018；4.江苏沿江地区农业科学研究所，江苏南通 226541；5.江苏中宝食品有限公司，江苏海门 226200）

维生素C（VC）是维持人体正常生理代谢必需的一类有机化合物，具有提高机体免疫力、抗氧化等生理作用[1-2]，但人体内不能合成VC，必须由食物供给。荠菜（Capsella bursa-pastoris.）是十字花科植物，在我国分布广泛。作为一种药食同源植物，荠菜富含维生素、黄酮、多糖、多酚等生物活性成分[3-4]，深受消费者的喜爱。

VC 具有强还原性，在空气中非常容易氧化，对热敏感。荠菜预处理过程中，由于长时间暴露在空气中，容易使样品中的VC 损失，从而影响样品测定的准确度和精确度。传统的VC 提取是将样品在酸溶液中破碎，常温下浸提[5-7]，提取时间长，VC 容易受环境影响而损失。超声波提取是利用超声波的强烈空化效应、扰动效应，增加溶剂的穿透力，加速溶剂对目标提取物的提取进程，缩短提取时间。与传统的提取法相比，超声波提取法最大优点是提取时间缩短，目标提取物的损失降低[8]。目前超声波提取技术已逐渐应用于天然植物有效成分、生物活性成分的提取研究中[4,9-10]。VC 含量的测定方法一般包括滴定法、比色法、电化学法、荧光法等，这些方法所需试剂较多，操作繁琐，影响测定效率。而高效液相色谱法由于其高效、稳定、可靠等特点，被广泛应用于果蔬中维生素C含量的测定[5]，特别是在分析大批量样品时，借助仪器的分析方法能更快更准确地进行含量测定。本研究建立了超声波提取荠菜中的VC，反相高效液相色谱测定VC 含量的方法，为荠菜等蔬菜中维生素C 含量的测定提供了试验资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荠菜，江苏中宝食品有限公司提供。

甲醇，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；VC，纯度≥99.0%，Sigma 公司；草酸等试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；0.45 μm 滤膜，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Waters 高效液相色谱仪，Waters1525 泵，Waters2489双通道紫外检测器；Breeze 色谱系统管理工作站，色谱柱：Fortis-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；液相平头微量进样器（25 μL）Eppendorf；HR2084 食品制样器，飞利浦公司；隔膜真空泵，天津市腾达过滤器件厂；UV-1801紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器有限公司；KQ2200 超声清洗机，昆山市超声仪器有限公司；电子天平（精确度0.1 mg），Sartorius 公司；高速冷冻离心机（SL 8R），Thermo 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 制备标准溶液

准确称量20.0 mgVC 标准品，用0.1%的草酸溶解，定容于100 mL 棕色容量瓶中，制成VC 标准储备液，低温避光保存。量取5.00 mLVC 标准储备液，用0.1%的草酸定容于50 mL 棕色容量瓶中，制成VC 标准工作液。再分别准确取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 的VC 标准工作液于10 mL 棕色容量瓶中，用0.1%的草酸定容，制成浓度为2～20 μg/mL 的VC 标准待测溶液。

1.3.2 检测波长的选择

以0.1%的草酸溶液作为空白对照，用紫外分光光度计在230～400 nm 波长范围内扫描测定VC 标准待测液（2～10 μg/mL）的吸光度，依据最大吸收波长选择试验的检测波长。

1.3.3 样品超声提取

准确称取100 g 去除黄叶的荠菜样品置于食品制样器中，加入100 mL 的1%草酸溶液，匀浆。准确称取5.00 g 匀浆样品放入50 mL 的离心管中，加入2%草酸40 mL，置于超声波仪中提取，100 W 功率，25 ℃超声提取10 min；4 ℃、9 000 r/min 离心，上清液用0.1%的草酸溶液转移定容至50 mL 的棕色容量瓶中，制成待测液。待测液用0.45 μm 滤膜过滤后进行HPLC 测定。

1.3.4 色谱分析

以Fortis-C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）为固定相，以0.1%的草酸溶液为流动相进行洗脱，流速：1 mL/min，进样量：25 μL，柱温：25 ℃，采用紫外检测器进行检测；待液相色谱基线稳定后进样分析，以保留时间定性，以峰面积外标法定量。

1.3.5 线性关系分析

浓度为2～20 μg/mL 的VC 标准待测溶液用0.45 μm滤膜过滤后，按1.3.4 色谱条件进行HPLC 测定。每个浓度进样3 次，以峰面积积分平均值为纵坐标，以VC 标准待测溶液浓度为横坐标进行线性回归分析。

1.3.6 重复性试验

取同一批次的荠菜样品6 份，按照1.3.3 的方法处理样品，每个样品按照1.3.4 的色谱条件进行3 次，取峰面积积分平均值，求出6 份样品中荠菜的含量，计算检测方法的重复性。

1.3.7 回收率试验

采用加标回收法，精密称取匀浆样品适量，加入VC标准品，按1.3.3 方法进行处理，每个样品按照1.3.4 的色谱条件测定3 次，取峰面积积分平均值，求VC 的含量，计算出检测方法的回收率。

1.3.8 检出限与定量限

以产生3 倍仪器噪声水平的进样量为检出限，以产生10 倍仪器噪声水平的进样量为定量限[12]。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

用紫外分光光度计扫描测定维生素C 标准待测液（2～10 μg/mL）的吸光度如图1 所示。由图1 可知，不同浓度VC 标准溶液的最大吸收波长在245 nm 左右，并且随着VC 标准浓度的增加，在最大吸收波长处的吸光度也增加。研究表明，在最大吸收波长±2 nm 的波长都可以作为检测波长[11]，因此波长在243～247 nm 都可作为检测波长。本研究中选择246 nm 作为检测波长。

2.2 色谱分离结果

色谱分离效果的主要影响因素为色谱柱的类别、流动相的种类和流动相的流速。在1.3.4 色谱条件下，VC 标准品溶液、荠菜提取液的色谱图如图2、3 所示，样品中VC 实现基线分离，峰形满足测定要求，VC 的保留时间为6.476 min，检测限为0.3 μg/mL，定量限为1 μg/mL。样品中VC 含量≥0.6 mg/100 g 可以定性；样品中VC 含量≥2 mg/100 g 可以定量。

2.3 标准工作曲线

以3 次进样的平均峰面积为响应值，以VC 标准品的进样浓度（μg/mL）为自变量，求直线回归方程为：y=75 480.2x-930.2，相关系数R2=0.999 8，样品中VC 的浓度在2～20 μg/mL 范围内，色谱峰峰面积与VC 的浓度呈良好的线性关系。

2.4 重复性试验

同一批次荠菜峰面积的平均值，带入回归曲线求出VC 含量，测定结果见表1。由表1 可知，荠菜中VC 含量为56.05 g/100 g，RSD 为1.97%，表明采取超声波辅助提取，反相高效液相色谱测定荠菜中VC 含量的方法重现性较好。

2.5 回收率试验结果

表2 回收率试验结果Table 2 Result of recovery test

回收率试验结果见表2，由表2 可知，添加量为10 mg/100 g 的样品，平均回收率为101.48%，RSD 值为1.84%；添加量为20 mg/100 g 的样品，平均回收率为99.73%，RSD 值为1.83%；添加量为40 mg/100 g 的样品，平均回收率为100.06%，RSD 值为0.35%，表明采用超声波提取、反相高效液相色谱法测定荠菜中VC 含量的方法准确可靠，符合色谱定量分析准确度的要求。

3 结论

本试验采用超声波辅助提取，过滤后用反相高效液相色谱来测定荠菜中的VC 含量。反相高效液相色谱测定VC 的方法线性范围为2～20 μg/mL，平均回收率为99.73%～101.48%，重复性良好，相对标准偏差为1.97%。方法检出荠菜中VC 含量的检出限为0.6 mg/100 g，定量限为2 mg/100 g，荠菜中VC 含量为56.05 g/100 g。VC 性质不稳定，易氧化分解，采用超声波辅助提取，能加快提取进程，避免VC 损失；同时使样品中的VC 易提取，测定的准确度和精密度好，可以用于蔬菜中VC 含量的定量测定。