一株抗辣椒疮痂病菌生防菌株的鉴定及其生防机制初探

詹梦琳　陈长江　罗晓华　胡方平　蔡学清

摘要：【目的】篩选获得对辣椒疮痂病菌具有拮抗效果的内生细菌，并对其生防机制进行初步探究，为辣椒疮痂病的生物防治提供菌株资源和理论依据。【方法】以课题组构建的内生细菌库中的268株菌株为研究对象，采用抑菌圈法筛选获得辣椒疮痂病菌的拮抗菌株;通过生理生化特性测定、16S rDNA序列和gyrB基因序列分析明确拮抗菌株的分类地位;通过PCR扩增检测拮抗菌株的脂肽类物质合成基因。【结果】从268株内生细菌中筛选获得189株对辣椒疮痂病菌具有不同拮抗效果的菌株，占筛选总菌株数的70.52%，其中菌株B10（3）对辣椒疮痂病菌的抑菌效果最好，培养4 d时抑菌圈半径为21.0 mm。综合菌株B10（3）的生理生化特性测定、16S rDNA序列和gyrB基因序列系统发育鉴定结果，推断该菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliqufaciens）。菌株B10（3）的代谢产物对辣椒疮痂病菌具有拮抗作用，且能扩增出8个脂肽类物质合成基因（ituC、yndG、srfAB、srfAA、yndJ、bmyB、bioA和fenD）的目的条带。【结论】解淀粉芽孢杆菌菌株B10（3）对辣椒疮痂病菌具有较好的拮抗效果，且具备合成脂肽类物质的能力，具有良好的应用前景。

关键词： 辣椒疮痂病菌;生防细菌;解淀粉芽孢杆菌;脂肽类合成基因

中图分类号： S436.418.19;S476.19            文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）12-2945-07

Abstract：【Objective】Screening out the antagonistic strains against Xanthomonas euvesicatoria，and their biological control mechanism were preliminarily explored， so as to provide strain resources for biological control against X. euvesicatoria. 【Method】There were 268 bacteria strains in endophytic bacteria library constructed by the research group. They were used to screen out the biocontrol bacterial strains against X. euvesicatoriaby inhibition zone method. And classification status of a biocontrol strain was determined by determination of physiological and biochemical characteristics， 16S rDNA identification and gyrB gene sequence analysis， and PCR amplification was used to detect whether it contained lipopeptide synthesis gene. 【Result】A total of 189 strains were found to inhibit X. euvesicatoria with various levels of effects from 268 endophytic bacteria strains， accounted for 70.52 % of the total selected strains. The strain B10（3） had the best antagonistic effects， and the radius of bacteriostatic zone was 21.0 mm at 4 d of culture. Based on the physiological and biochemical characteristics， 16S rDNA sequence and gyrB genes sequence analysis， the strain was identified as Bacillus amyloliqufaciens. The metabolites of this strain had antagonistic effect on X. euvesicatoria， and it could amplify 8 target bands of lipopeptide synthesis genes（ituC，yndG，srfAB，srfAA，yndJ，bmyB，bioA and fenD）. 【Conclusion】The strain B10（3） of B. amyloliqufaciens has good antagonistic effect on X.euvesicatoriawith the ability to synthesize lipopeptide，it has a good potential application prospect.

Key words： Xanthomonas euvesicatoria; biocontrol bacteria; Bacillus amyloliqufaciens; lipopeptide synthesis gene

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2017YFD0201106-02）; Science and Techno-logy Innovation Project of Fujian Agriculture and Forestry University（KFA17541A）

0 引言

【研究意义】由植物病原菌Xanthomonas euvesicatoria引起的辣椒疮痂病（即辣椒细菌性斑点病）俗称疱病、三落病，是世界范围内普遍发生的一种辣椒病害，该病害不仅大幅降低辣椒的产量，且严重影响辣椒的果实品质，进而造成经济损失（Jones et al.，2004;龙玲等，2009;陳新等，2011）。目前对该病害主要采用化学药剂进行防治（杨子祥等，2014），但近年来由于化学防治带来的农药残留、病菌抗药性和环境污染等问题，使得科研工作者不断地寻找更安全有效的防治途径，而生物防治因具有安全、有效和无污染等优势成为目前的研究热点（杨海莲等，2000;杨光伟等，2015）。因此，开展对辣椒疮痂病菌拮抗细菌的筛选及其生防机制研究，对保障辣椒产业的可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】对于茄科作物细菌性疮痂病的生物防治已有一些研究报道，针对疮痂病菌的生物防治方法主要有利用生防细菌（Byrne et al.，2004）、植物根际促生菌（Ji et al.，2005）、噬菌体（Iriarte et al.，2007）和病原hrp突变菌株（Moss et al.，2007）等。其中，关于生防细菌的研究报道，Byrne等（2004）利用丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）、恶臭假单胞菌（P. putida）和荧光假单胞菌（P. fluorescens）等对番茄疮痂病进行温室和大田防治试验，结果显示丁香假单胞菌Cit7在田间的防治效果最好，可将病害发生严重程度降低28.9%;El-Hendawy等（2005）利用水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）对番茄的种子、叶片、根系和土壤进行处理，发现该菌可降低番茄疮痂病的发病程度，并对植株生长有一定促进作用;赵聪（2014）通过平板对峙试验、离体生防试验和温室盆栽防病试验，发现解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliqufaciens）Hy-7和Z2-13的脂肽类粗提物对辣椒疮痂病菌具有明显的抑制作用且具有良好生防效果;Chandrasekaran等（2019）通过维生素B6生物合成相关基因的表达谱分析和盆栽试验发现，枯草芽孢杆菌（B. subtilis）CBR05可作为系统抗性诱导剂诱导番茄维生素B6的生物合成，进而提高番茄对疮痂病菌的抗病性。国内关于筛选辣椒疮痂病拮抗细菌及其机制研究的相关报道并不多见。【本研究切入点】辣椒疮痂病是影响辣椒种植的重要病害之一，近年来由于化学防治带来的病菌抗药性及环境污染等问题，人们急需寻找新的替代方法，但目前有关辣椒疮痂病拮抗菌的报道较少。【拟解决的关键问题】在本课题组构建的内生细菌库基础上，通过抑菌圈法筛选辣椒疮痂病菌的拮抗生防细菌，继而对具有较好抑菌效果的菌株进行常规和分子生物学鉴定，并探讨其拮抗机制，旨在获得对辣椒疮痂病菌具有拮抗效果的生防菌株，为辣椒疮痂病的生物防治提供菌株资源和理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 供试菌株 辣椒疮痂病菌（X. euvesicatoria）及268株内生细菌菌株（包括解淀粉芽孢杆菌Hy-7）均由福建农林大学植物细菌实验室分离和保存;枯草芽孢杆菌标准菌株BS168由福建农林大学植物细菌实验室保存。

1. 1. 2 供试引物 16S rDNA基因通用引物，参照Lane（1991）;gyrB基因引物，参照Yamamoto和Harayama（1995）;脂肽类物质合成基因检测引物，参照Joshi和McSpadden Gardener（2006）。具体见表1。

1. 2 生防菌株筛选

采用抑菌圈法（洪鹏翔等，2007）进行筛选。

1. 3 生防菌株鉴定

1. 3. 1 生理生化测定 以枯草芽孢杆菌标准菌株BS168为对照菌株，革兰氏染色反应、运动性测定、硝酸还原反应、耐盐性测定、丙二酸盐和柠檬酸盐利用测定、过氧化氢酶测定、淀粉水解酶测定、甲基红试验和吲哚试验参照方中达（1998）的方法，V-P试验参照东秀珠和蔡妙英（2001）方法，糖醇类物质利用测定参照Huang等（2012）的方法。

1. 3. 2 16S rDNA序列和gyrB基因序列分析 参照Lane（1991）的方法进行16S rDNA基因鉴定;参照Yamamoto和Harayama（1995）的方法进行gyrB基因分析。以供试菌株的总DNA为模板，分别用16S rDNA的通用引物和gyrB基因的特异性引物进行PCR扩增，在凝胶成像仪下观察扩增结果，将条带大小正确的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，获得的序列通过NCBI的BLAST检索系统进行序列同源性分析。选取同源性最近的序列及相关的模式菌株序列，用MEGA 7.0进行比对分析，采用邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建16S rDNA的系统发育进化树，采用最大似然法（Maximum-likelihood，ML）构建gyrB基因的系统发育进化树。

1. 4 生防菌株的生防机制测定

1. 4. 1 生防菌株代谢产物对辣椒疮痂病菌的拮抗作用 采用牛津杯法（许英梅等，2018）进行测定。

1. 4. 2 脂肽类物质合成基因检测 以解淀粉芽孢杆菌菌株Hy-7为阳性对照（杨瑞先等，2013），参照Joshi和McSpadden Gardener（2006）的方法，通过脂肽类物质合成基因的特异性引物进行PCR扩增。

2 结果与分析

2. 1 辣椒疮痂病菌生防菌株筛选结果

2. 1. 1 生防菌株对辣椒疮痂病菌的抑制作用 通过抑菌圈法筛选对辣椒疮痂病菌具有拮抗作用的菌株，结果表明，从供试的268株细菌菌株中获得189株对辣椒疮痂病菌具有不同拮抗效果的菌株，占筛选总菌株数的70.52%，无拮抗效果的菌株79株，占筛选总菌株数的29.48%。其中抑菌圈半径（r）≥20 mm的菌株14株，占筛选总菌株数的5.22%，抑菌圈半径在5～20 mm的菌株138株，占筛选总菌株数的51.49%。

对抑菌圈半径≥20 mm的14株菌株进一步复筛（生防细菌悬浮液OD600≈0.9，病原菌悬浮液OD600≈1.5），结果（表2和图1）显示，供试菌株的抑菌圈半径随着培养时间的延长而增大，当培养4 d时，菌株B10（3）的抑菌圈半径最大，为21.0 mm。因此，选取菌株B10（3）进行鉴定并初步探讨其生防机理。

2. 2 生防菌株鉴定结果

2. 2. 1 生理生化测定 由表3可知，菌株B10（3）为革兰氏阳性菌，具有运动性，能利用海藻糖、麦芽糖、甜醇、山梨醇、甘露醇、丙三醇、丙二酸盐和柠檬酸盐，硝酸还原反应、淀粉水解酶测定、过氧化氢酶测定和V-P试验为阳性，甲基红试验和吲哚试验为阴性，耐盐性7%。菌株B10（3）的生理生化测定结果除耐盐性外均与对照菌株BS168一致，推测菌株B10（3）属于芽孢杆菌属。

2. 2. 2 16S rDNA序列和gyrB基因序列分析 对供试菌株B10（3）的16S rDNA基因和gyrB基因进行PCR扩增及序列测定分析，获得供试菌株的16S rDNA基因和gyrB基因的核苷酸序列长度分别为1506和1206 bp，与目标条带大小一致。将供试菌株的序列在NCBI数据库上进行在线同源性比对分析，结果发现，供试菌株与解淀粉芽孢杆菌的相似性在99%以上。利用MEGA 7.0分別采用NJ法和ML法构建系统发育进化树，结果（图2和图3）显示，菌株B10（3）与芽孢杆菌属的B. amyloliqufaciens聚成一支，推断该菌株为解淀粉芽孢杆菌属（B. amyloliqufaciens）。

2. 3 生防菌株脂肽类合成基因扩增结果

牛津杯法测定结果表明，生防菌株B10（3）的代谢产物对辣椒疮痂病菌具有拮抗作用，接种后2 d，菌株B10（3）代谢产物的抑菌圈半径约为5.0 mm。进一步通过脂肽类合成基因的特异性引物进行PCR扩增，检测菌株B10（3）是否具备合成脂肽类物质的能力。以解淀粉芽孢杆菌菌株Hy-7为阳性对照，脂肽类合成基因ituC（575 bp）、yndG（372 bp）、srfAB（308 bp）、srfAA（273 bp）、yndJ（212 bp）、bmyB（395 bp）、bioA（210 bp）和fenD（293 bp）的特异性引物扩增结果（图4）显示，菌株B10（3）均可扩增到对应的基因片段，由此推断该菌株具备合成脂肽类物质的能力。

3 讨论

植物内生细菌具有稳定性高、生物作用时效性长、可作为外源基因载体等优点（杨海莲等，2000;蔡学清等，2012），是一类具有巨大潜力的植物病害生防资源菌。近年的研究发现，植物内生细菌的种类主要有芽孢杆菌属（Bacillus）、肠杆菌属（Enterobacter）、土壤杆菌属（Agrobacterium）和假单胞杆菌属（Pseudomonas）等（喻江等，2015），其中，芽孢杆菌属的细菌具有生长繁殖速度快、耐热性及抗逆性等优点，是一种相对理想的生防细菌（朱玥妍等，2012）。本研究筛选获得的植物内生生防细菌B10（3）为解淀粉芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌是目前作为生防芽孢杆菌进行研究和开发的主要菌种之一，具有广阔的应用前景。

已有研究表明，解淀粉芽孢杆菌对柑橘溃疡病、西瓜细菌性果斑病、辣椒疮痂病、花生白绢病和黄瓜枯萎病等多种植物病害均具有良好的防治效果（孙燕霞等，2010;赵聪，2014; 陆燕等，2016 ），其主要抑菌活性物质有抑菌蛋白、脂肽类物质和聚酮化合物等（吴一晶等，2012），其中脂肽类抗生素包括表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）和丰原素（Fengycin）等（Koumoutsi et al.，2004）。Grady等（2019）研究发现解淀粉芽孢杆菌9D-6产生的表面活性素、Medeot等（2019）研究发现解淀粉芽孢杆菌MEP218产生的丰原素均对疮痂病菌具有明显的抑制作用，但Hossain等（2015）研究发现srfAA基因控制合成的表面活性素并不是解淀粉芽孢杆菌菌株AP193起拮抗作用的脂肽类物质，说明并非所有种类的脂肽类物质均具有良好的拮抗效果。本研究通过牛津杯法证明菌株B10（3）的代谢产物对辣椒疮痂病菌具有拮抗作用，且可扩增获得8种脂肽类物质合成基因的特异性条带，其中包括控制合成表面活性素、伊枯草菌素和丰原素等的相关基因，表明该菌株可能通过合成脂肽类物质抑制辣椒疮痂病菌的生长，但具体是哪类物质、或是其中一种或几种物质协同作用，需进一步探究。

目前对辣椒疮痂病具有较好防效的解淀粉芽孢杆菌菌株报道依旧很少，筛选以获得对辣椒疮痂病具有防效的生防细菌是实现该病害生物防治的前提。本研究筛选获得的菌株B10（3）具有较好的抑菌作用，有望为辣椒疮痂病的生物防治提供菌种资源，但有研究表明，室内平板的拮抗作用与田间的防效并非都成正相关（Nagendra et al.，2019），因而本研究获得的菌株B10（3）对于辣椒疮痂病的温室及大田防治效果尚需进一步验证。

4 结论

本研究在课题组构建的植物内生细菌库中通过抑菌圈法筛选获得1株对辣椒疮痂病菌具有拮抗效果的生防菌株B10（3），通过革兰氏染色、生理生化测定和分子生物学方法将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌，该菌株可扩增到8个脂肽类物质合成基因目的条带，具备合成脂肽类物质的能力，具有良好的应用前景。

参考文献：

蔡学清，谢玲平，胡方平. 2012. 黄瓜枯萎病菌内生拮抗细菌的筛选与鉴定[J]. 武夷科学，28：114-119. [Cai X Q，Xie L P，Hu F P. 2012. Screening and identification of the antagonistic and endophtic bacteria to Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum[J]. Wuyi Science Journal，28：114-119.]

陈新，刘清波，赵廷昌. 2011. 辣椒细菌性疮痂病病原菌分类、检测及综合防治研究进展[J]. 植物保护，37（1）：11-18. [Chen X，Liu Q B，Zhao T C. 2011. Recent advances in bacterial spot caused by Xanthomonas campestris pv. vesi-catoria of pepper and tomato[J]. Plant Protection，37（1）：11-18.]

东秀珠，蔡妙英. 2001. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 第2版. 北京：科学出版社：372-373. [Dong X Z，Cai M Y. 2001. Manual for systematic identification of common bacteria[M].  The 2nd Edition. Beijing： Science Press：372-373.]

方中达. 1998. 植病研究方法[M]. 第3版. 北京：中国农业出版社：195-211. [Fang Z D. 1998. Plant disease research method[M]. The 3rd Edition. Beijing： China Agriculture Press：195-211.]

洪鵬翔，邱思鑫，陈航，赵秀丹，胡方平. 2007. 4种茄科作物内生细菌的分离及拮抗菌的筛选[J]. 福建农林大学学报（自然科学版），36（4）：347-351. [Hong P X，Qiu S X，Chen H，Zhao X D，Hu F P. 2007. Isolation and screening of endophytic antagonistic bacteria from four species of Solanaceae[J]. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University（Natural Science Edition），36（4）：347-351.]

龙玲，刘红梅，夏忠敏，虞秀兰，熊咏，黎藜. 2009. 辣椒疮痂病发生规律及防治技术[J]. 贵州农业科学，37（2）：75-77. [Long L，Liu H M，Xia Z M，Yu X L，Xiong Y，Li L. 2009. Occurrence regularity of scab disease on hot pepper and its control techniques[J]. Guizhou Agricultural Sciences，37（2）：75-77.]

陆燕，李澄，陈志德，杨宜红，唐灿明. 2016. 解淀粉芽孢杆菌41B-1对花生白绢病的生防效果[J]. 中国油料作物学报，38（4）：487-494. [Lu Y，Li C，Chen Z D，Yang Y H，Tang C M. 2016. Biological control activities of Bacillus amyloliquefaciens 41B-1 against Sclerotium rolfsii[J]. Chinese Journal of Oil Crop Sciences，38（4）：487-494.]

孙燕霞，张瑞清，刘保友，袁堂玉，刘万好. 2010. 白地霉和解淀粉芽孢杆菌对黄瓜枯萎病的防治效果[J]. 山东农业科学，（12）：55-57. [Sun Y X，Zhang R Q，Liu B Y，Yuan T Y，Liu W H. 2010. Control effect on cucumber Fusa-rium wilt by Geotrichum candidum and Bacillus amyloliquefaciens[J]. Shangdong Agriculture Sciences，（12）：55-57.]

吴一晶，林艺芬，林河通，陈艺晖，陈梦茵，姜萍. 2012. 生防菌解淀粉芽孢杆菌研究进展[J]. 包装与食品机械，30（6）：49-52. [Wu Y J，Lin Y F，Lin H T，Chen Y H，Chen M Y，Jiang P. 2012. Advances in the researches of biocontrol bacteria Bacillus amyloliquefaciens[J]. Packaging and Food Machinery，30（6）：49-52.]

许英梅，何德民，高连连，申东财，朴永哲，张秋民. 2018. 小兴安岭松木醋液的生物活性及抑菌性能研究[J]. 大连民族大学学报，20（3）：193-197. [Xu Y M，He D M，Gao L L，Shen D C，Piao Y Z，Zhang Q M. 2018. Research on the bioactivity and antibacterial activity of pine vinegar in Lesser Khingan[J]. Journal of Dalian Minzu University，20（3）：193-197.]

杨光伟，刘慧芹，孙丽丽，盛锦霞，刘玉姗，赵廷昌. 2015. 番茄疮痂病生物防治研究进展[J]. 中国蔬菜，（6）：17-22. [Yang G W，Liu H Q，Sun L L，Sheng J X，Liu Y S，Zhao T C. 2015. Research prospects in biological control of tomato bacterial spot[J]. China Vegetables，（6）：17-22.]

楊海莲，孙晓璐，宋未. 2000. 植物根际促生细菌和内生细菌的诱导抗病性的研究进展[J]. 植物病理学报，30（2）：106-110. [Yang H L，Sun X L，Song W. 2000. Current development on induced resistance by plant growth promoting and endophytic bacteria[J]. Acta Phytopathologica Sinica，30（2）：106-110.]

杨瑞先，范晓静，蔡学清，陶玉凤，胡方平. 2013. 两株银杏内生拮抗细菌菌株的鉴定及生防功能基因研究[J]. 热带作物学报，34（3）：466-472. [Yang R X，Fan X J，Cai X Q，Tao Y F，Hu F P. 2013. Identification of two endophytic bacterial strains isolated from Ginkgo biloba and study of their biocontrol function genes[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，34（3）：466-472.]

杨子祥，苏银玲，杨长楷，麻继仙，但忠，木万福. 2014. 云南干热区番茄疮痂病的发生与防治[J]. 长江蔬菜，（1）：52-54. [Yang Z X，Su Y L，Yang C K，Ma J X，Dan Z，Mu W F. 2014. Occurrence and control of tomato scab in Yunnan dry hot area[J]. Journal of Changjiang Vegetables，（1）：52-54.]

喻江，于镇华，刘晓冰，王光华. 2015. 植物根组织内生细菌多样性及其促生作用[J]. 中国农学通报，31（13）：169-175. [Yu J，Yu Z H，Liu X B，Wang G H. 2015. Diversity and growth promoting effects of endophytic bacteria in plant roots[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，31（13）：169-175.]

赵聪. 2014. 内生解淀粉芽孢杆菌脂肽类物质的作用及fenA1基因功能研究[D]. 福州：福建农林大学. [Zhao C. 2014. The fenA1 gene function and the effect of lipopeptide substances extracted from Bacillus amyloliquefaciens strains.[D]. Fuzhuo： Fujian Agriculture and Forestry University.]

朱玥妍，刘姣，杜春梅. 2012. 芽孢杆菌生物防治植物病害研究进展[J]. 安徽农业科学，40（34）：16635-16638. [Zhu Y Y，Liu J，Du C M. 2012. Research progress of biological control in plant diseases by Bacillus spp.[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，40（34）：16635-16638.]

Byrne J M，Dianese A C，Ji P，Campbell H L，Cuppels D A，Louws F J，Miller S A，Jones J B，Wilson M. 2004. Biological control of bacterial spot of tomato under field conditions at several locations in North America[J]. Biological Control，32（3）：408-418.

Chandrasekaran M，Paramasivan M，Chun S C. 2019. Bacillus subtilis CBR05 induces Vitamin B6 biosynthesis in tomato through the de novo pathway in contributing disease resistance against Xanthomonas campestris pv. vesicatoria[J]. Scientific Reports，9（1）：6495.

El-Hendawy H H，Osman M E，Sorour N M. 2005. Biological control of bacterial spot of tomato caused by Xanthomonas campestris pv. vesicatoria by Rahnella aquatilis[J]. Microbiological Research，160（4）：343-352.

Grady E N，MacDonald J，Ho M T，Weselowski B，McDowell T，Solomon O，Renaud J，Yuan Z C. 2019. Characterization and complete genome analysis of the surfactin-producing，plant-protecting bacterium Bacillus velezensis 9D-6[J]. BMC Microbiology，19（1）：5.

Hossain M J，Ran C，Liu K，Ryu C M，Rasmussen-Ivey C R，Williams M A，Hassan M K，Choi S K，Jeong H，Newman M，Kloepper J W，Liles M R. 2015. Deciphering the conserved genetic loci implicated in plant disease control through comparative genomics of Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum[J]. Frontiers in Plant Science，6：631.

Huang Q，Yan X R，Wang J F. 2012. Improved biovar test for Ralstonia solanacearum[J]. Journal of Microbiological Methods，88（2）：271-274.

Iriarte F B，Balogh B，Momol M T，Smith L M，Wilson M，Jones J B. 2007. Factors affecting survival of bacteriophage on tomato leaf surfaces[J]. Applied and Environmental Microbiology，73（6）：1704-1711.

Ji P，Campbell H L，Kloepper J W，Jones J B，Suslow T V，Wilson M. 2005. Integrated biological control of bacterial speck and spot of tomato under field conditions using foliar biological control agents and plant growth-promoting rhizobacteria[J]. Biological Control，36（3）：358-367.

Jones J B，Lacy G H，Bouzar H，Stall R E，Schaad N W. 2004. Reclassification of the Xanthomonads associated with bacterial spot disease of tomato and pepper[J]. Systematic and Applied Microbiology，27（6）： 755-762.

Joshi R，McSpadden Gardener B B. 2006. Identification and characterization of novel genetic markers associated with biological control activities in Bacillus subtilis[J]. Phytopathology，96（2）：145-154.

Koumoutsi A，Chen X H，Henne A，Liesegang H，Hitzeroth G，Franke P，Vater J，Borriss R. 2004. Structural and functional characterization of gene clusters directing nonribosomal synthesis of bioactive cyclic lipopeptides in Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42[J]. Journal of Bacteriology，186（4）： 1084-1096.

Lane D J. 1991. 16S/23S rDNA sequencing[M]//Stackebrandt E，Goodfellow M. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. New York： Wiley： 115-175.

Medeot D B，Fernandez M，Morales G M，Jofré E. 2019. Fengycins from Bacillus amyloliquefaciens MEP218 exhibit antibacterial activity by producing alterations on the cell surface of the pathogens Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria and Pseudomonas aeruginosa PA01[J]. Fron-tiers in Microbiology，10：3107.

Moss W P，Byrne J M，Campbell H L，Ji P，Bonas U，Jones J B，Wilson M. 2007. Biological control of bacterial spot of tomato using hrp mutants of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria[J]. Biological Control，41（2）：199-206.

Nagendra S，Christopher G T，Pierce A P，Sally A M. 2019. Combining partial host resistance with bacterial biocontrol agents improves outcomes for tomatoes infected with Ralstonia pseudosolanacearum[J]. Crop Protection，135：104776.

Yamamoto S，Harayama S. 1995. PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analy-sis of Pseudomonas putida strains[J]. Applied and Environmental Microbiology，61（3）：1104-1109.

（責任编辑 麻小燕）