拓扑DNA在壳聚糖纳米粒子中的固定化负载

Annang Elsie Odua，张亚青，Chiteme Tafadzwa Evangelista，柳 永,2,3，刘士旺,2,3

(1.浙江科技学院 生物与化学工程学院，杭州 310023；2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，杭州 310023；3.浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心，杭州 310023)

脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)是生物遗传信息的携带者，同时也是一种功能多样的生物高分子。双链DNA(dsDNA)的解链构象-单链DNA(ssDNA)，既是基因编辑的重要靶标物[1]，也是DNA材料研究的常见原料[2]。ssDNA在体外常温下倾向于互补配对形成部分双链结构，这对常温下研究ssDNA生物学活性和操作ssDNA材料造成了阻碍。已知dsDNA在受热情况下，能够解链形成并保持ssDNA结构。如能将高温下的ssDNA结构固定化，则将为常温下研究ssDNA的生物学功能和ssDNA基功能材料研发提供有益参考。

壳聚糖(chitosan，CS)是天然阳性多糖，已被大量研究证实为优良的核酸载体。已见报道的CS/DNA复合物大致可以分为4类：1)非靶向CS/DNA纳米粒子，如CS/超螺旋DNA和CS/dsDNA/siRNA复合纳米粒子[3]、改性CS/超螺旋DNA纳米粒子[4]等，均表现出良好的哺乳细胞转染功能；2)靶向CS/DNA复合纳米粒子，如靶向大脑的锰福地吡-CS/siRNA/DNA纳米粒子[5]、靶向肿瘤细胞的CS纳米粒子[6]等；3)智能响应CS/DNA复合纳米粒子，如ATP响应[7]、氧化还原响应[8]、磁场响应CS纳米转染制剂[9]等；4)CS/DNA基人工模拟物，如CS/DNA基人工模拟酶，表现出高催化活性和高抗逆性[10]。相比种类繁多的CS/核酸复合纳米粒子报道，关于CS与核酸相互作用机制及其对细胞侵染效率的影响报道相对较少。现有研究表明，CS与DNA间弱相互作用力有利于对哺乳细胞的转染[11]，CS上氨基与DNA上磷酸基团的比例对转染效率存在显著影响[12]，具有支化结构的CS较线型CS具有更好的基因递送效果和更佳的细胞相容性[13]等。这些研究虽对CS/DNA相互作用与其基因转染效果间关系进行了探索性研究，但对分子水平的相互作用机制研究报道仍较少。石幻君等[14]发现磺化壳聚糖铁配合物可通过嵌插作用来解链dsDNA。Shen等[15]通过动态分子模拟发现，DNA上带负电磷酸基团与CS上带正电氨基之间的互作是壳聚糖负载DNA的主要机制。

综合以上研究可以发现，正电性CS与负电性DNA间的静电自组装是CS包埋DNA的主要作用机制。如能在体外制备携带单链区段的DNA，并在保持ssDNA构象条件下引发壳聚糖与DNA间的共聚，则有可能实现不稳定ssDNA拓扑构象的固定化。因此，我们采用热处理的方法，制备携带单链区段的线型DNA，并与CS共聚形成复合纳米粒子，对不稳定ssDNA在复合纳米粒子中的固定化负载效果进行分析评价。

1 材料与方法

1.1 试验材料

壳聚糖(粘均相对分子质量150 kDa，脱乙酰度90%以上)，国药集团化学试剂有限公司；鲑鱼精DNA(D1626)，美国Sigma-Aldrich公司，其0.25 mg/mL水溶液A260/A280=1.92，A260/A230=2.35；SYBR Green Ⅰ荧光染料，美国MP Biomedicals公司；其他常规生化试剂均为国产分析纯。

1.2 dsDNA热处理及解链度测定

将鲑鱼精DNA溶解于超纯水中，配置质量浓度为55 ng/μL的DNA溶液。取DNA溶液0.5 mL与SYBR Green Ⅰ原液(×10 000母液)0.5 μL混合均匀，于37 ℃下避光孵育1 h。将经过孵育的DNA溶液分装于20个0.2 mL平盖PCR管中，在荧光定量PCR仪CFX96上，分别于25、60、90 ℃下测量SYBR Green Ⅰ的绿色荧光信号强度。以25 ℃下测得荧光信号值为100% dsDNA荧光信号值，将60 ℃和90 ℃下荧光信号值与25 ℃荧光信号值相除，计算各温度下dsDNA的百分比含量。

1.3 携带单链区段DNA在壳聚糖复合纳米粒子中的负载

将CS溶解于1%醋酸溶液中，并以NaOH溶液调节pH值，配制质量浓度为1 mg/mL，pH值为5.5的CS溶液。将鲑鱼精DNA溶解于超纯水中，质量浓度为0.25 mg/mL。

在25 ℃下，按CS与DNA质量比为4/1、1/1和1/2，将DNA溶液在磁力搅拌下滴加到CS溶液中。在60、90 ℃下，按CS与DNA质量比为4/1，将DNA溶液在磁力搅拌下滴加到CS溶液中。DNA滴加溶液逐渐呈现蓝白色荧光(后续检测表明CS与DNA共聚形成了复合纳米粒子)。

1.4 复合纳米粒子表征

傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR)分析采用傅里叶变换红外光谱仪Paragon 1000型(美国Perkin Elmer公司)，在500～4 000 cm-1范围内扫描，样品与KBr粉末混合后压成薄片测定；差示扫描量热分(differential scanning calorimetry，DSC)分析采用差示扫描量热仪DSC Q100 V9.9 Build 303型(美国TA Instruments公司)，冷冻干燥样品质量为3～5 mg，先将样品从室温降到-40 ℃，保持3 min，然后以20 ℃/min升温到250 ℃；粒径分布和zeta电位分析采用Zetasizer 3000HS型(美国马尔文仪器有限公司)，以纳米溶液直接测定；透射电子显微镜观察(transmission electron microscope，TEM)采用JEM-1200EX型号(日本JEOL公司)，制样方法为悬滴法。

2 结果与讨论

2.1 不同温度处理下DNA的解链度

图1 CS/DNA复合纳米粒子FT-IR分析

SYBR Green Ⅰ能够与dsDNA的小沟结合，结合后的荧光信号可增强800～1 000倍。在25 ℃下，dsDNA结构稳定，SYBR Green Ⅰ与DNA充分结合，在蓝光(497 nm)激发下发射绿色荧光信号(520 nm)。当温度升高到60 ℃和90 ℃时，dsDNA部分解链产生ssDNA区段。在ssDNA区段上，DNA小沟消失，SYBR Green Ⅰ从相关位点脱落，520 nm下荧光信号减弱。同时，未解链dsDNA区段SYBR Green Ⅰ仍结合于DNA小沟上，荧光信号得到保持。将60 ℃和90 ℃下荧光信号值分别与25 ℃下荧光信号值相除即可计算相应处理温度下的dsDNA的百分比含量，并推算出相应的ssDNA百分比含量。结果显示，在60、90 ℃下dsDNA的百分比含量分别为66.9%±1.8%、10.5%±1.3%，ssDNA百分比含量分别为33.1%±1.5%、89.5%±1.9%。表明在25、60、90 ℃处理下，获得了具有不同解链度的DNA样品。60、90 ℃处理下产生的ssDNA在温度降低后会重新形成链内或链间dsDNA结构，表现为不稳定拓扑结构。

2.2 复合纳米粒子的FT-IR分析

CS/DNA复合纳米粒子FT-IR分析结果如图1所示，A、B、C对应样品为25 ℃下DNA与CS质量比分别为4/1、1/1、1/2时制备纳米粒子；D、E对应样品为DNA与CS质量比为4/1时，分别在60、90 ℃下制备纳米粒子；F为DNA，G为CS。从图1可知，DNA在1 236 cm-1和1 095 cm-1处吸收峰分别为磷酸基团(PO21-)反对称伸缩振动和对称伸缩振动峰[16-17]，在CS包埋DNA形成的复合纳米粒子中，当CS与DNA比例(CS/DNA)为4/1或1/1时，上述两处吸收峰微弱。在CS/DNA为1/2样品中，上述两处吸收峰强度高于4/1或1/1样品。这表明，在4/1或1/1的CS/DNA比例下，DNA上的磷酸基团被充分固定化，对称振动减弱；而在1/2比例下，较多磷酸基团保留了对称振动状态。磷酸基团是DNA骨架的主要结构基团，CS/DNA复合纳米粒子中DNA磷酸基团的固定化，意味着DNA结构的固定化。Shen等[15]的CS负载DNA分子动态分子模拟研究报道，同样认为DNA上带负电磷酸基团与CS上带正电氨基之间的相互作用是壳聚糖负载DNA的主要机制。此外，DNA在1 236 cm-1处吸收峰是B -DNA特征峰[18]，在CS/DNA复合纳米粒子中，该处吸收峰的减弱表明CS可能与其他多胺类高分子一样，能够诱导天然右手螺旋B -DNA转变为左手螺旋Z -DNA[19]。DNA在965 cm-1处的吸收峰为其主链核糖振动吸收峰，在复合纳米粒子中该振动峰向低波数方向移动到了927 cm-1，也表明复合纳米粒子中的DNA结构得到了固定化。对于复合纳米粒子中DNA解链度问题，由于DNA与CS之间及DNA碱基对之间存在多种氢键作用力且氢键构成基团相似，因此无法从傅立叶变换红外光谱中有效解析获得DNA的解链度信息。

2.3 复合纳米粒子DSC分析

图2 CS/DNA复合纳米粒子DSC分析

CS/DNA复合纳米粒子DSC分析结果如图2所示，A、B、C、D、E、F、G对应样品与图1同。由图2可知，天然鲑鱼精DNA在43～125 ℃出现较平缓吸热单峰，峰值温度为83 ℃，该峰为dsDNA解链形成ssDNA过程吸热所致。在227 ℃附近出现的放热峰则为DNA氧化分解放热所致。CS在-30～250 ℃未出现明显吸放热峰。相比天然鲑鱼精DNA，CS/DNA复合纳米粒子的峰形和数量发生了显著变化：首先，5个CS/DNA复合纳米粒子样品(A、B、C、D和E)均在59 ℃附近出现第1个吸热峰，该峰为dsDNA局部解链DNA呼吸增强所致；其次，25 ℃或60 ℃下制备的4个CS/DNA复合纳米粒子样品(A、B、C和D)，均在68.8～117.3 ℃间出现了第2个吸热峰，该峰为dsDNA完全解链吸热所致；最后，227 ℃附近未见DNA氧化分解放热峰出现，表明经CS包埋保护后dsDNA的分解温度得到了提高。比较样品A、B和C可以看出，当CS/DNA为4/1时，DNA完全解链温度最高，为117.3 ℃。这一升高DNA完全解链温度与较高CS/DNA比例下(4/1)，过量CS与DNA饱和相互作用导致DNA热稳定性提高有关[20]，同时也表明CS/DNA为4/1下，DNA与CS相互作用饱和度较高，有利于DNA拓扑结构的固定化。进一步比较样品A、D和E可以看出，相同CS/DNA比例下，制备温度分别为25、60、90 ℃时，DNA完全解链吸热峰逐渐向低温方向移动。由于在DNA序列相同的情况下，DNA的解链温度与其双链区段长度呈正相关，因此制备温度从25 ℃升到90 ℃过程中，CS/DNA复合纳米粒子中，dsDNA区段呈逐渐缩短趋势，相应ssDNA区段呈增长趋势。这表明，在60、90 ℃下产生的携带单链区段的DNA拓扑结构，在复合纳米粒子中得到了固定化。

2.4 复合纳米粒子的粒径分布与zeta电位

表1CS/DNA复合纳米粒子粒径分布与zeta电位分析结果

Table1Analytic results of particle size distribution and zeta potential of CS/DNA composite nanoparticles

样品平均粒径/nmzeta电位/mVA573.9±20.819.53±1.2B750.1±34.023.81±3.1C388.2±26.421.17±1.9D205.0±15.914.31±1.2E210.5±17.2 9.75±0.8

CS/DNA复合纳米粒子粒径分布与zeta电位分析结果见表1，A、B、C、D、E对应样品与图1同。由表1可知，当制备温度为25 ℃时，伴随CS/DNA比例降低，复合纳米粒子平均粒径和zeta电位均出现先升高后降低的变化；当CS/DNA比例固定为4/1时，伴随制备温度升高，复合纳米粒子平均粒径和zeta电位均呈降低趋势。制备温度为25 ℃时，不同CS/DNA比例导致的平均粒径和zeta电位差异，可能与CS和DNA聚集程度不同有关。当CS/DNA比例均为4/1时，不同制备温度下(25、60、90 ℃)出现的粒径和zeta电位差异，应与DNA的解链度不同有关。在25 ℃下，天然鲑鱼精DNA主要以双链形式存在，分子刚性较强，与CS共聚形成较大纳米颗粒(平均水合粒径573.9 nm)；在60、90 ℃下，鲑鱼精DNA发生解链，以双链/单链双重结构形式存在，分子刚性减弱，容易与CS共聚缠绕形成较小纳米颗粒(平均水合粒径分别为205、210.5 nm)。而伴随制备温度升高，zeta电位逐渐降低(由19.53 mV降到9.75 mV)，可能是较高制备温度下含量较高ssDNA的存在降低了DNA与CS的聚集度，导致了复合纳米粒子内正电性CS比例的降低。

2.5 TEM分析

对CS/DNA比例均为4/1，制备温度分别为25、60、90 ℃的样品A、D、E进行了TEM观测，结果见图3。从图3可以看出，3个制备温度下复合纳米粒子形貌差异显著。在25 ℃下制备样品(A)，复合纳米颗粒粒径较大，存在大量粒径大于100 nm的复合纳米颗粒，且颗粒中部多存在低电子密度区域，应为电子密度较低的DNA集中分布区域。在60 ℃下制备样品(D)，粒径大于100 nm的复合颗粒减少，粒径小于100 nm的复合颗粒显著增多，颗粒中低电子密度区域明显减少。在90 ℃下制备样品(E)，仍存在部分粒径大于100 nm的复合颗粒，但以粒径小于100 nm的复合颗粒为主，颗粒内部低电子密度区域消失。由于A、D、E样品间的主要差别是制备温度不同，即DNA解链度不同，因此3个样品间复合纳米颗粒结构差异主要由构成复合纳米颗粒的DNA拓扑结构差异造成。同时也反映出，在3个制备温度下，携带不同比例ssDNA区段的稳定或不稳定DNA拓扑结构均被固定化负载到了复合纳米颗粒中。

图3 不同温度制备壳聚糖/DNA复合纳米粒子透射电子显微镜下形貌

3 结 语

通过差异加热处理，制备了携带不同比例ssDNA区段的拓扑结构稳定或不稳定的DNA，并在相应温度下制备了CS/DNA复合纳米粒子，使得DNA的拓扑结构在复合纳米粒子中得到了固定化。尤其在CS/DNA为4/1情况下，FT-IR测试中DNA主链上磷酸基团和糖链振动均出现减弱；DSC测试中第二吸热峰伴随制备温度升高向低温方向迁移的行为，也与热处理导致的DNA双链区段长度变化预期相符；粒径分布、zeta电位和TEM测试等进一步反映出负载不同拓扑结构DNA的纳米粒子，在形貌和结构特征上存在显著差异。这些结果均有力地证明，携带单链区段的拓扑结构DNA在复合纳米粒子中获得了良好的固定化。