CPP诱导无定型磷酸钙及羟基磷灰石在牛牙釉质再矿化中的应用比较

刘 萍 伍 鹏 宁科功

(云南白药集团股份有限公司 云南 昆明650217)

引言

酪蛋白磷酸肽( casein phosphopeptide，CPP)是由牛乳酪蛋白经胰蛋白酶降解产生的富含成簇磷酸丝氨酰基的多肽。研究表明CPP 通过自身结构中大量的磷酰基团，在中性或碱性条件下可结合亚稳定状态的无定型磷酸钙( amorphous calcium phosphate，ACP) ，形成酪蛋白磷酸肽-无定型磷酸钙复合物( casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate，CPPACP)，显著增强磷酸钙的溶解能力[1]，增加牙釉质表面钙离子和磷酸离子浓度，有利于牙齿表层再矿化。

羟基磷灰石(HAP Ca10(PO4)6(OH)2)是人牙釉质的主要无机成分，约占总成分的97%以上,基本单元是针状和柱状的磷灰石晶体[1], 长约40nm, 宽约20nm.牙釉质再矿化的化学本质是磷酸钙体系的结晶过程；HAP生成经历由磷酸八钙〔Ca8H2(PO4)6·5H2O〕→非晶态磷酸钙〔Ca8(PO4)2·XH2O〕→缺钙磷灰〔Ca10-Z(HPO4)Z(PO4)6-Z(OH)2-Z·XH2O→羟基磷灰石〔Ca10(PO4)6(OH)2·XH2O〕的复杂的相转变过程[2,5]；鉴于纳米羟基磷灰石特殊作用, 而其形状和尺寸是其显示纳米效应的关键, 因此,对纳米HAP晶体的生成进行有效调控, 以制备出与牙釉质相同结晶形态，并能够生长于原釉质上的HAP就可以修复受损牙釉质；尽管羟基磷灰石同牙釉质中的无机成分相似, 具有优良的生物学性能。但是羟基磷灰石在牙表面降解缓慢, 因此采用非结晶形态的无定型磷酸钙来直接代替稳定的羟基磷灰石作为牙釉质再矿化的钙、磷源，可以改善降解性能及增强釉质再矿化速度。

本研究以CPP为诱导剂，分别将羟基磷灰石及无定型磷酸钙作为钙、磷源，分别对受损牛齿牙釉质进行再矿化比较；以期找出能够修复受损牛牙釉质的方法；并展望了该技术在修复人牙釉质中的应用。

1 实验部分

1.1主要试剂和仪器

CPP( WAKO，日本)；羟基磷灰石(上海紫临生物科技有限公司)；JSM-6460扫描电镜(SEM)(日本JEOL会社); 维氏硬度计(THVS-5Z)。

1.2实验样本制备

选取同一环境下同一批次的牛牙，收集新拔除的牛下切牙，体视显微镜(×10) 选唇侧釉质完整、表面光滑、颜色正常、无白斑、无裂痕、无磨损的牙;去净软组织，超声洗涤，切取冠部釉质块。每个釉质块的唇侧用800目砂纸磨出小平面，超声洗涤，取3mm×2mm开窗区，其余部分用抗酸指甲油封闭，生理盐水冷藏(4℃) 保存备用[3]。

1.3实验溶液配制

1.3.1配制CPP-ACP矿化液:2g CPP溶解于144mmol /L磷酸钠缓冲液( pH=7.0)50ml中，电磁力搅拌器搅拌，逐滴加入1mol /L的CaCl2溶液12ml，用KOH 维持恒定pH值; 用去离子水调整溶液体积至100ml。最终配制含2%CPP，120mmoL/L CaCl2，72mmoL/L磷酸钠( pH=7.0) 的CPP-ACP溶液[4]。经倍比稀释得到1%CPP-ACP和0.5% CPP-ACP溶液。

1.3.2羟基磷灰石矿化液：分别将0.5g、1g、2g CPP溶解于100ml水中，并分别加入2g的固体羟基磷灰石粉末，磁力搅拌混合2h备用。

1.3.3配制人工唾液:0.07g CaCl2，0.04g MgCl2，2.23g KCl,0.54g KH2PO4，4.76g羟乙基哌嗪乙磺酸溶于800mL去离子水中，用NaOH调pH值至7.0，去离子水定容至1000mL。

1.4牙釉质修复实验

取56个釉质块标本随机分为7组，每组8个样本，分别置于0.5% CPP-ACP溶液、1.0% CPP-ACP溶液、2.0% CPP-ACP溶液、0.5% CPP-HAP混合液、1% CPP-HAP混合液、2% CPP-HAP混合液和去离子水7种溶液中;37℃水浴振荡15min后取出；放入按1∶1的比例配制的人工唾液中，37℃恒温保存。每日(24h)取出釉质块，重复以上步骤，共15天。然后取出牙釉质块，吹干，通过扫描电镜观察受损牙釉质再矿化情况。

1.5矿化修复后牙釉质硬度的测定

在维氏显微硬度计测定各实验样品的表面硬度，载荷50g，保荷15s。每个釉质块表面每个区域测3个点，各点相距200～300μm，结果取平均值[6]。

2 结果与讨论

2.1CPP-ACP对牙釉质修复的影响

图1～图4是牛牙釉质及其在不同浓度的CPP-ACP中的再生情况的SEM图片。

图1 牛牙釉质表面SEM

图2 0.5%CPP-ACP对牛牙釉质修复的SEM

图3 1% CPP-ACP对牛牙釉质修复的SEM

图1.1 牛牙釉质表面EDS Ca:P=1.95

图2.1 0.5%CPP-ACP对牛牙釉质修复的EDS Ca:P=1.83

图3.1 1% CPP-ACP对牛牙釉质修复的EDS Ca:P=1.99

图4 2% CPP-ACP对牛牙釉质修复的SEM

图4.1 2% CPP-ACP对牛牙釉质修复的EDS Ca:P=1.99

图1.1是空白牛齿的EDS,空白受损牛齿表面为柱状羟基磷灰石结晶，其钙磷比为Ca:P=1.95；实验结果显示，0.5%～2.0% CPP-ACP均可促进受损牛牙釉质沿固有方向生长，相同时间内0.5%、1%、2%的CPP-ACP诱导牙釉质沿固有方向生长的长度分别是：小于10nm、介于10nm～50nm、大于50nm; 高浓度的CPP-ACP能更好的诱导受损牛齿表面的羟基磷灰石沿固有方向生长；且当浓度大于1%以后，其钙磷比Ca:P=1.99与原釉质的Ca:P=1.95更接近；对受损牛牙釉质修复效果更好。

2.2CPP-HAP对受损牛牙釉质修复的影响

图5、图6、图7分别是不同浓度CPP-HAP对受损牛牙釉质修复情况的SEM及EDS图，图片显示各个浓度下CPP-HAP皆能在受损牛牙釉质表面形成不规则的结晶，且致密程度比CPP-ACP更紧密，新长出的矿物质呈层状堆积；钙磷比与未矿化的牛牙釉质(Ca:P=1.95)相近分别是1.96、1.83、1.93；说明在受损牛牙釉质表面形成的磷酸钙盐结合形式也是羟基磷灰石形态，但其结晶生长形态与原牛牙釉质完全不同，随CPP浓度增加，再矿化的牛牙釉质厚度增加，但呈非有序、非连续状态。

图5 0.5%CPP-HAP对牛牙釉质修复的SEM

图6 1%CPP- HAP对牛牙釉质修复的SEM

图 5.1 0.5%CPP-HAP对牛牙釉质修复的EDS Ca:P=1.96

图6.1 1%CPP-HAP对牛牙釉质修复的EDS Ca:P=1.83

图7 2%CPP-HAP对牛牙釉质修复的SEM图

图7.1 2%CPP-HAP对牛牙釉质修复的EDS Ca:P=1.93

2.3硬度

表1是受损牛牙釉质在不同再矿化液中生长15天后，吹干，并用维氏显微硬度计测定各实验样品的表面硬度，载荷50g，保荷15s。每个釉质块表面每个区域测3个点，各点相距200～300μm，结果取平均值，从表1可知，无论是CPP-ACP还是CPP-HAP再生的牙釉质硬度都无法直接达到原釉质的硬度293HV；CPP-ACP诱导原釉质有序生长，新长出的釉质硬度与原釉质接近，且随CPP浓度增加釉质硬度增强，最大硬度为252HV;而CPP-HAP诱导再生的牙釉质硬度下降较大，其硬度依然随CPP浓度的增大而增强,最大硬度为182HV。

表1 受损牛牙釉质在不同再矿化液中再矿化15天后的硬度表

2.4讨论

从以上实验结果来看，尽管牛牙釉质中的主要无机物是羟基磷灰石，然而在修复受损牛牙釉质的实验中，酪蛋白磷酸肽(CPP)诱导无定型磷酸钙可以更好的修复牙釉质，且可以诱导新长出的釉质沿其固有方向生长，形成的新釉质硬度与原釉质硬度更接近，酪蛋白磷酸肽也可以直接诱导结晶型羟基磷灰石再矿化修复受损牛牙釉质，但是不能够诱导原釉质沿固有方向结晶，而是在受损牛牙釉质表面形成片层结构，且硬度比原釉质小100HV以上；二者相比CPP-ACP效果更好的原因，牙釉质再矿化的化学本质是磷酸钙体系的结晶过程；从晶体结晶过程需要三个阶段，一是过饱和溶液形成，二是形成晶核，第三是形成晶体[1,7,8]；在牛牙釉质再生这个过程中晶核的形成过程是取决定性作用的过程和势能最大的过程，CPP-ACP体系过饱和溶液中钙和磷都是以离子的形态存在；晶核的形成是以受损牛齿釉质本身的晶体为晶核来生长的，加上CPP本身通过电荷吸附于牛齿釉质表面[5,8]诱导新形成的羟基磷灰石生长，随着CPP-ACP浓度的增加，其维持钙磷离子浓度的能力提高，再矿化效果亦增加。所以形成的新釉质与原釉质层性状及硬度都更加接近；而在CPP-HAP体系中，虽然体系中的HAP与原釉质的组成一致，但是要修复牙釉质，则需让已经结晶的HAP经历溶解形成过饱和钙、磷离子体系，再经过CPP诱导成核再结晶的过程[9,10]，因为HAP在该体系的溶解度很低，所以很难形成高浓度的过饱和溶液，再加上本来HAP具有一定的结晶形态，当溶解以后，过饱和离子因其成核需要的势能过高，更倾向于在原来的HAP晶核上再结晶，虽然经CPP诱导其再矿化过程也发生在受损牛齿的表面，但其结晶形态则受到添加的HAP自身的结晶形态影响，形成了片层结构，其结晶形态的不同亦导致硬度与固有釉质的硬度差异。

3 结论与展望

在人工唾液及37℃培养箱中，CPP-ACP体系及CPP-HAP体系均可以诱导受损牛齿釉质矿化再生；且再生程度随CPP浓度增加而增加；CPP-ACP体系诱导再生牛牙釉质的能力大于CPP-HAP体系，与原釉质结晶形态、钙磷比及硬度都更加结近，CPP-ACP可以提供更有利于牛牙釉质再生所需要的钙、磷离子，且没有其它晶核影响再矿化晶体生长，在CPP的诱导下再矿化的新釉质更倾向于沿固有晶体结构生长，更有利于新釉质的形成；本实验采用的是与人齿结近的牛齿为研究对象，虽然研究结果中新生的牛牙釉质与原釉质还有一定的差别，但基本达到了受损牛牙釉质再生的目的；由于采用的原料安全，该实验也有望在人牙釉质再生中实现，可以彻底改变通过氟化物来强化牙釉质的现状，从而解决氟化物可能引起的中毒等问题，同时牙釉质是牙齿第一层保护基质，牙釉质修复技术可以解决牙齿的敏感、蛀牙、美白等问题，其应用前景非常广阔。