屏南县羊口疮病的诊断和PCR流行病学调查

陆李枝

摘 要：羊口疮病是屏南县羊养殖过程中常见的疾病之一，制约了屏南县养羊产业的健康发展。为了确定屏南县临床羊口疮病的病原以及了解该病在屏南县的流行情况，为该病的科学防治提供依据。采用PCR方法检测了12份县域内临床羊口疮病的病原，并随机采集了县域内6家规模养羊场（户）217份羊只血样进行羊口疮病的流行病学调查。结果表明：12份病例的病变组织、血样提取的病毒基因组DNA样品均扩增出约500 bp片段，與预期片段大小一致，明确了引起屏南县临床羊口疮病的病原为羊口疮病毒（ORFV）;屏南县6家规模养羊场（户）的羊口疮病毒（ORFV）感染率为14.63%～33.33%，平均感染率为25.99%;抽样调查的群体中有羊口疮临床病症的羊只均为1～3月龄羔羊，各养殖场临床发病率为0～16.33%，平均发病率为9.69%，低于羊群羊口疮病毒（ORFV）感染率。

关键词：羊口疮;流行病学;PCR诊断;屏南县

中图分类号：S826 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2020）01-0046-04

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.01.008

Diagnosis and PCR Epidemiological Investigation of Sore Mouth Disease in Pingnan County

LU Li zhi

（Pingcheng Town Animal Husbandry and Veterinary Station of Pingnan County， Ningde， Fujian 352399， China）

Abstract： The sore mouth disease is one of the common diseases in sheep breeding in Pingnan County， which has restricted the healthy development of sheep breeding industry in Pingnan County. By determining the pathogen of clinical sore mouth disease in Pingnan County and understanding the prevalence of the disease in Pingnan County， it would provide a basis for the scientific prevention and treatment of the disease. PCR was used to detect the pathogens of 12 cases of clinical sore mouth disease in the county， and a total of 217 sheep blood samples were randomly collected from 6 large scale sheep farms （households） in the county for epidemiological investigation. The results showed that the DNA samples of viral genome extracted from the pathological tissue and blood samples of the 12 cases were amplified to approximately 500 bp fragments， which were consistent with the expected fragment size， so it was identified that the pathogen causing clinical sore mouth disease in Pingnan County was ORFV. The infection rate of ORFV in 6 large scale sheep farms （households） in Pingnan County was 14.63%-33.33%， with an average infection rate of 25.99%. Among the sampled groups， all the sheep with clinical symptoms of sore mouth disease were 1-3 month old lambs， and the clinical incidence rate of each farm was 0-16.33%， with an average incidence rate of 9.69%， which was lower than the infection rate of ORFV.

Key words： Sore mouth disease; Epidemiology; PCR diagnosis; Pingnan County

屏南县位于福建东北部鹫峰山脉中段，全县草场总面积2.88万hm2，占山地面积的24.2%。天然草场年日照平均总时数为1720 h，年活动积温为4565.6℃，冬暖夏凉，十分有利于牧草生长，为肉羊产业的发展提供了得天独厚的资源。近年来，屏南县肉羊产业的规模养殖已初见成效，百头以上的规模养羊场约占屏南县年末存栏总数的80%[1]。

羊口疮病是由羊口疮病毒（orf virus，ORFV）感染引起羊急性、接触性人畜共患病，患病羔羊的采食和吸吮乳汁受到严重影响，还易并发其他疫病，是造成养羊产业经济损失的主要疫病之一[2]。目前缺乏用于临床治疗羊口疮病的特效药，采用取弱毒活疫苗进行防治也存在毒力返强的风险，造成了该病防治的困难[3]。因此，开展羊口疮病的流行病学调查，掌握病毒在羊群中的分布，是预防疾病的关键举措[4-5]。为了解屏南县养殖羊群的羊口疮病分布与发病情况，在全县范围内采用PCR方法开展羊口疮病原的诊断，为该病的科学防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1病样采集及流行病学调查

以2018年3月至6月间县域内12份临床诊断为羊口疮病的病羊为研究对象，每个病例分别采集口、唇部结痂病变组织约100 mg和抗凝颈静脉血0.5 mL。采集的组织加入约2 mL生理盐水，研磨后收集匀浆1 mL，-20℃保存备用;病例颈静脉血放置于2 mL灭菌离心管中，-20℃保存备用。

1.2病毒基因組DNA提取病毒DNA提取试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司，病变组织样本取200 uL匀浆液，血液取200 uL，均按照试剂盒的操作说明分别进行各样品病毒基因组DNA的提取，提取的病毒基因组DNA于-20℃保存备用。

1.3羊口疮病毒（ORFV）PCR扩增的引物设计与反应体系

用于羊口疮诊断的PCR引物参考颜新敏等[5]设计，目的扩增片段长度为507 bp。上游引物为：5′-CGAACTTCCACCTCAACCACTCC-3′，下游引物为：5′-CCTTGACGATGTCGCCCTTCT-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR扩增体系为：提取的病毒基因组DNA 模板2 uL，2×Premix Taq酶（北京全式金生物科技有限公司）10 uL，上下游引物（25 pmol·uL-1）各1 μL，无菌ddH2O 6 uL。PCR反应条件：94℃变性2 min，40个循环扩增（94℃50 s、56℃40 s、72℃30 s），72℃延伸5 min，4℃1 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.4 羊口疮病毒（ORFV）的PCR检测

分别以12份羊口疮病例的病变组织、血样提取的病毒基因组DNA为模板进行PCR扩增，并以等量无菌ddH2O替代模板设置空白对照，扩增后进行凝胶电泳。

1.5 屏南县羊口疮病毒（ORFV）流行病学调查

于2018年7月至10月，在屏南县县域内6个乡镇百头以上规模户进行羊口疮病的流行病学调查，每个羊场按存栏量的30%进行随机抽样。抽中的羊只利用加抗凝的一次性采血针采集0.5 mL颈静脉血，-20℃存放备用。检测方法参照以上方法。

2 结果与分析

2.1 羊口疮病毒（ORFV）的PCR检测结果

由图1可知，12份病例的病变组织、血样提取的病毒基因组DNA样品均扩增出约500 bp片段，与预期片段大小一致，空白对照则无条带。表明引起屏南县临床羊口疮病的病原为羊口疮病毒（ORFV），该PCR诊断方法可用于临床羊口疮病的病原诊断，利用PCR技术可以检测羊只血液羊口疮病毒（ORFV）的感染情况。

2.2 屏南县羊口疮病毒（ORFV）的流行病学调查结果

屏南县6家存栏量百头以上养羊规模场（户）的羊口疮病流行病学调查结果见表1。由表1可知，各养殖户羊群均存在羊口疮病毒的感染，感染率为14.63%～33.33%，平均感染率为25.99%，说明羊口疮病在屏南县广泛存在且感染率较高。抽样调查的群体中有羊口疮临床病症的羊只均为1～3月龄羔羊，各养殖场临床发病率为0～16.33%，平均发病率为9.69%，低于羊群羊口疮病毒（ORFV）的感染率，这主要是由于3月龄以上的感染羊只并非临床发病羊只。经过对抽样羊只个体的对比，临床发病羊只血液羊口疮病毒（ORFV）的PCR检测均为阳性，进一步证实了PCR技术对羊口疮病毒（ORFV）诊断的准确性。

3 讨论

我国多地均有羊口疮病的报道，给养羊产业造成了巨大的经济损失[6]。在临床上，羊只感染羊口疮病后的症状与羊痘、口蹄疫等疫病的症状非常相似，特别是存在继发或混合感染时，更增加了临床诊断的难度

[7]。因此，能准确对临床感染病羊进行病原确诊以及定期调查羊口疮病原在羊群中的分布是科学防治该疫病的关键[8]。利用电镜、病毒分离等常规病毒诊断方法确诊羊口疮病毒费时费力，且需要昂贵的设备，不适合在临床诊断中应用，而血清学诊断往往存在交叉反应[9]。目前常利用羊口疮病毒（ORFV）的特异保守序列设计引物，进行PCR扩增后进行羊口疮病毒的临床确诊[4-5]。常亮等[7]研究表明利用PCR方法检出羊口疮病毒（ORFV）的最低量为5 pg。林裕胜等[10]建立的羊口疮病毒（ORFV）和丝状支原体双重PCR方法对羊口疮病毒（ORFV）的最低检测出量为3.8×104 Copies·uL-1，具有良好的特异性和敏感性。本研究表明羊口疮发病羊只的病变组织和血样的PCR检测结果均为100%阳性，进一步证实了利用PCR技术在临床上检测羊口疮病毒，具有快速、简单和准确性高的优点，且其对试验条件要求较低，适用于一般实验室诊断。

羊口疮病在屏南县养殖羊群中的流行由来已久，2007年苏雅英[11]在屏南县屏城乡散养户中临床诊断了羊口疮病的疑似病例，但缺乏对病原的确诊认定。董晓宁等[4]首次在福建省开展了羊口疮病的流行病学调查，表明该病在福建省的发病率为10%～20%，与本研究调查的屏南县羊口疮病发病率为0～16.33%的结果较为一致。屏南县羊口疮病的流行病调查结果表明羊群羊口疮病毒（ORFV）的感染率高于发病率，常亮等[7]对甘肃东部地区羊口疮病毒PCR检测调查表明该地区羊群羊口疮感染率远高于发病率，与本研究结果一致。分析认为造成这一现象的原因：一方面是由于部分羊只发病的临床症状轻，造成临床诊断的漏诊，另一方面放牧羊口疮病多发于6月龄以内的羔羊，但病毒会在6月龄以上的羊群中长期携带[7]。

目前临床治疗羊口疮的特效药尚缺乏，且通过药物治疗传染性疫病也并不经济，通过疫苗接种仍然是免疫防治羊口疮病的主要方法[12]。但由于羊口疮病毒免疫的特殊性和其他一些原因，至今为止尚未研制成功安全、高效的羊口疮病毒疫苗，临床上常用的弱毒疫苗存在毒力返强等缺点[13]。因此，在生产中科学防控羊口疮病的先决条件是掌握羊口疮病毒（ORFV）在羊群中的流行情况，在此基础上加强对易感羔羊的照料，对发病羊只及时治疗，隔离带毒羊群和易感羊群，逐步淘汰老、弱带毒羊只，定期消毒以减少病毒在羊群中的感染机会。

参考文献：

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[7]常亮，郭海龙，党岩.甘肃东部地区羊口疮病毒PCR检测调查[J].中兽医学杂志，2016（4）：98-99.

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[11]苏雅英.疑似山羊口疮及继发肺炎的治疗[J].福建畜牧兽医，29（4）：71.

[12]李智，张七斤，安维雪，等.羊口疮疫苗对兔体液免疫和细胞免疫的影响[J].中国动物检疫，2016（11）：89-93，107.

[13]林裕胜，江锦秀，林甦，等.羊传染性脓疱病毒研究进展[J].动物医学进展，2016（2）：91-96.

（责任编辑：林玲娜）