高产莫纳可林K、低产桔霉素的红曲霉菌株筛选及其发酵条件优化

2020-03-23 07:10庄月娥陈华观

福建农业科技 2020年1期

庄月娥陈华观

摘要：筛选高产莫纳可林K、低产桔霉素的红曲霉菌株，为后期红曲工艺的开发和应用奠定基础。以福建省古田县不同品牌的红曲米為原料，分离纯化并筛选出高产莫纳可林K、低产桔霉素的红曲霉菌株。最后，通过单因素试验对纯种红曲的发酵条件进行优化。结果表明：通过筛选得到15株（编号为M1～M15）红曲霉菌，经HPLC测定莫纳可林K和桔霉素的含量，显示M8菌株的桔霉素含量为1.40 μg·g-1，莫纳可林K含量为3950 μg·g-1，选为最优红曲霉出发菌种。进一步优化M8菌株的发酵条件，发现在pH值4.5、培养温度25℃和培养时间11 d的情况下，红曲霉M8菌株的莫纳可林K产量最高，可达4160 μg·g-1。试验筛选得到了1株高产莫纳可林K、低产桔霉素的红曲霉菌株，扩大了高产莫纳可林K的菌株选择。

关键词：红曲霉;桔霉素;莫纳可林K;发酵条件

中图分类号：TS202.3 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2020）01-0006-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.01.002

Screening of Monascus Strains with High yielding Monacolin K and

Low yielding Citrinin and the Optimization of Fermentation Conditions

ZHUANG Yue e1， CHEN Hua guan2

（1. Quanzhou Medical College， Quanzhou， Fujian 362000， China; 2. Quanzhou Comprehensive Enforcement

Team of Market Supervision， Quanzhou， Fujian 362000， China）

Abstract： The strains of Monascus with high yielding monacolin K and low yielding citrinin were screened， in order to lay a foundation for the later development and application of red koji technology. The different brands of red yeast rice from Gutian County， Fujian Province was used as raw material to isolate and purify the strains of Monascus with high yielding monacolin K and low yielding citrinin. Then， the fermentation conditions of pure red koji were optimized by single factor experiment. The results showed that 15 strains （M1-M15） were obtained through screening， and the contents of monacolin K and citrinin were determined by HPLC， indicating that the content of citrinin in M8 strain was 1.40 μg·g-1， and the content of monacolin K was 3950 μg·g-1， which was selected as the optimal starting strain of Monascus. By further optimizing the fermentation conditions of M8 strain， it was found that under the conditions of pH value 4.5， culture temperature 25℃ and culture time 11 d， the content of monacolin K in M8 strain of Monascus was the highest， reaching 4160 μg·g-1. Therefore， a strain of Monascus with high yielding monacolin K and low yielding citrinin was screened from the experiment， thus to expand the selection of the strains with high yielding monacolin K.

Key words： Monascus; Citrinin; Monacolin K; Fermentation conditions

红曲是红曲霉菌寄生在大米发酵后形成，现已广泛应用于酿酒工艺、食醋生产、食品着色剂和防腐剂等方面，是我国重要的传统食品和中药材之一[1]。红曲最早始用于唐代，在中国已有1000多年的应用历史，《本草纲目》中记载有“消食活血、健脾燥胃”等功效。人们常常用其来酿制红曲酒作为妇女产后调理使用，主要产地为浙江、福建、台湾等省份，其中，以福建省古田县生产的红曲最具有代表性[2]。

红曲霉菌在大米发酵后可以产生许多代谢产物，如红曲色素、γ 氨基丁酸、抗菌物质、莫纳可林K（monacolin K）和桔霉素等。1979年Endo等[3]在红曲霉培养液中分离得到了莫纳可林K类活性物质，并发现这类活性物质能够抑制胆固醇合成，有效地调节血脂，是一种安全性高、应用效果好的血脂调节物。1995年，Blanc等[4]在红曲霉的代谢产物中分离得到了一种真菌桔霉毒素，具有致癌和致畸等作用。因此，利用生物技术手段选育高产莫纳可林K、低桔霉素的红曲霉菌，对于开发利用传统微生物资源具有非常重要的理论和现实意义[5]。

本试验以福建省古田县不同品牌的红曲米为原料，筛选1株生长较好、高产莫纳可林K、低产桔霉素的红曲霉菌，并以莫纳可林K产量为指标，通过单因素试验对纯种红曲的发酵条件进行优化，为今后开发利用红曲霉产品和规模化生产莫纳可林K提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

福建省古田县18种不同品牌红曲米。

1.2 培养基

麦芽汁培养基：麦芽提取物20 g、蛋白栋10 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、蒸馏水1000 mL、pH 5.4;种子培养基：蛋白栋25 g、NaNO3 2 g、MgSO4·7H2O 1 g、K2HPO4 1 g、ZnSO4·7H2O 2 g、甘油100 mL、蒸馏水1000 mL;液态发酵培养基：甘油100 mL、玉米浆20 mL、NaNO3 10 g、C2H3NaO2 10 g、C5H11O2NS 5 g、K2HPO4 5 g、MgSO4·7H2O 2 g、蒸馏水1000 mL。

1.3 主要试剂和仪器

1.3.1 主要试剂桔霉素标准品（青岛普瑞邦生物工程有限公司），莫纳可林K标准品（中国药品生物制品检定所），其他化学试剂均为分析纯。

1.3.2 主要仪器高效液相色谱仪[沃特世科技（上海）有限公司];Agilent5TCC18（2）色谱柱，250 mm×4.6 mm，5 μm（安捷伦科技有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 分离纯化分别取产地为福建省古田县的18种不同品牌红曲米（编号为Q1～Q18）各10 g，放入带有玻璃珠的90 mL无菌水三角瓶中，摇床培养30 min，此为10

-1浓度菌液，吸取l mL 10-1浓度菌液至9 mL无菌水中，此为10-2 浓度菌液，以此类推，分别依次稀释成10-3、10-4、10-5、10-6浓度菌液。分别吸取0.1 mL各梯度浓度菌液，涂布于麦芽汁平板，32℃培养4 d。

从培养基中挑取符合红曲霉微生物学特征的菌种进行分离纯化，转接至固体培养基进行32℃培养4 d，每天在显微镜下进行菌落形态观察和生物鉴定[6]。

1.4.2 菌株筛选分别挑取单菌落于麦芽汁培养基32℃培养7 d。接种菌丝于种子液培养基，摇瓶转速120 r·min-1，32℃培养7 d。将种子液1∶20比例接种于液态发酵培养基中，32℃培养10 d。利用HPLC对发酵产物中的桔霉素和莫纳可林K进行含量测定，初筛选出高产莫纳可林K、低产桔霉素的菌株。通过连续传代培养检测其遗传稳定性：于4月开始每隔1个月（共6个月）转接1次斜面，同时进行活化培养，测定桔霉素和莫纳可林K含量[7]。

1.4.3 M8菌株产莫纳可林K发酵条件的优化以发酵液莫纳可林K的含量为评价指标进行单因素试验，因素水平设计为：（1）发酵液初始pH 5.5、摇瓶转速120 r·min-1、发酵温度25℃的条件下，发酵时间设为5、6、7、8、9、10、11、12、13 d;（2）发酵液初始pH 5.5、摇瓶转速120 r·min-1、发酵时间10 d的条件下，发酵温度设为20、25、30、35℃;（3）发酵温度 25℃、摇瓶转速120 r·min-1、发酵时间10 d的条件下，发酵液初始pH值设为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。分别研究上述不同发酵条件对红曲霉菌产莫纳可林K的影响。

1.5 测定方法

1.5.1 桔霉素的生物鉴定在45℃左右的条件下，将3 mL含2%酵母膏、4%葡萄糖、0.75%琼脂培养基与枯草芽孢杆菌混匀，均匀地倒在20 mL 2%硬琼脂上。取在YES培养基上30℃培养11 d的红曲霉菌落放在软琼脂表面，32℃培养0.5d，测量抑菌圈直径[8]。

1.5.2 桔霉素含量测定液相色谱条件[9]，色谱柱：Agilent 5TC C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）;荧光检测器：激发波长331 nm，发射波长500 nm，流速1.0

mL·min-1;等度洗脱流动相∶甲醇∶纯水（磷酸调pH 4）=55∶45，进样量20μL，柱温保持28℃。

标准曲线：称取1 mg标准品溶解于50 mL甲醇溶液中，配制成20 mg·L-1溶液。稀释成浓度为2、4、6、8、10、12 mg·L-1标准液。

提取方法：2 mL发酵液，加入4 mL乙醇，60℃水浴1 h，冷却后，8000 r·min-1离心10 min，取上清液用0.22 μm有机微孔滤膜过滤。

1.5.3 莫纳可林K含量测定液相色谱条件[10]，检测波长238 nm，流速1.0 mL·min-1;梯度洗脫流动相比例：乙腈∶0.1%磷酸缓冲液（0～6 min，60∶40;6～24 min，60～95∶40～5;26～30 min，95～60∶5～40）进样量10 μL，柱温保持在35℃。

标准曲线：称取50 mg标准品溶解于10 mL乙腈溶液中，配制成5 mg·mL-1溶液。吸取2 mL溶液于10 mL容量瓶中，配制成浓度为1 mg·mL-1标准液，再稀释成浓度为0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mg·mL-1标准液。

提取方法：2 mL发酵液，加入6 mL无水乙醇，500 W超声20 min，70℃水浴2 h，冷却后，8000 r·min-1离心10 min，取上清液用0.22 μm有机微孔滤膜过滤。

2 结果与分析

2.1 红曲霉菌的分离纯化

根据红曲霉的微生物形态特征，通过稀释平板分离法从福建古田红曲中分离得到了15株红曲霉菌株，编号为M1～M15。

2.2 红曲霉菌株的筛选

2.2.1 红曲霉菌株桔霉素和莫纳可林K含量测定研究表明，枯草杆菌可以作为红曲霉产桔霉素的指示菌，可利用枯草杆菌对红曲霉菌进行生物鉴定[11]。同时，通过固体发酵，HPLC测定桔霉素和莫纳可林K的含量（表1）。结果表明，红曲霉菌产桔霉素是一个普遍现象，且抑菌圈越大，桔霉素含量越高。经过初筛，在测试的15株红曲霉菌中，M8菌株产生的莫纳可林K含量最高，桔霉素含量最低。因此，选定M8菌株作为进一步研究的出发菌种。

2.2.2 红曲霉M8菌株的形态特征通过肉眼和显微镜观察32℃培养12 d后M8菌株的微生物形态特征：菌落呈橙红色，直径约35 mm，表面有褶皱和气生菌丝，边缘不光滑;菌丝粗细大体一致，有隔膜、分支，球状的分生孢子位于菌丝末端，子囊孢子为椭圆形或圆形。

2.2.3 红曲霉M8菌株的稳定性每隔1个月转接1次斜面，同时活化进行红曲米培养，再测定桔霉素和莫纳可林K含量。结果（表2）显示，红曲霉M8菌株的遗传性比较稳定。

2.3 发酵条件的优化

2.3.1 发酵时间对红曲霉M8菌株莫纳可林K产量的影响不同发酵时间对红曲霉M8菌株的莫纳可林K产量的影响结果如图1所示。从图1可以发现，莫纳可林K产量随着发酵时间的延长而增加，但发酵时间到达11 d以后，就基本上达到了平衡状态。因此，发酵时间能够直接影响红曲霉的生长和莫纳可林K的产量。

2.3.2 发酵温度对红曲霉M8菌株莫纳可林K产量的影响不同发酵温度条件下红曲霉M8菌株的莫纳可林K产量如图2所示。从图2可以发现，发酵温度对莫纳可林K产量有较大的影响，随着发酵温度的提高，莫纳可林K产量增加，温度达到25℃时，产量达到最高值，之后产量逐渐降低。因此，最适合M8红曲霉菌株的发酵温度为25℃。

2.3.3 pH值对红曲霉M8菌株莫纳可林K产量的影响 pH是影响红曲霉生长的关键因素，且红曲霉是腐生真菌、嗜酸[12]。不同pH对红曲霉M8菌株莫纳可林K产量的影响如图3所示。从图3可以发现，随着pH值的增加，红曲霉M8菌株莫纳可林K的产量逐渐增加，当pH值为4.5时，红曲霉M8菌株莫纳可林K的产量达到最高值，之后产量逐渐降低。因此，最适合红曲霉M8菌株生长的pH值为4.5。

2.3.4 红曲霉M8菌株在优化发酵条件下的培养效果在最优发酵条件下（500 mL三角瓶装大米50 g、物料厚度4 cm），25℃培养11 d，红曲霉M8菌株中莫纳可林K产量最高，可达4160 μg·g-1。

3 讨论与结论

本研究从不同来源的福建古田红曲米中，分离纯化得到15株（编号为M1～M15）红曲霉菌株，经过对上述品种红曲霉菌发酵后的桔霉素和莫纳可林K进行含量测定，初步筛选得到了1株高产莫纳可林K、低产桔霉素的红曲霉M8菌株作为最优红曲霉菌。对M8菌株的发酵条件进一步优化，发现其在pH值4.5、培养温度25℃和培养时间11 d的情况下，莫纳可林K产量最高，可达4160 μg·g-1。从试验结果可以发现，桔霉素和莫纳可林K的质量分数主要由红曲霉菌种本身决定。发酵条件对上述两种物质的产量也有较大的影响。

研究表明，莫纳可林K是一种优良的次生代谢物，除了有调节血脂、降低血压、抑制胆固醇等功能，同时，在免疫系统调节、胆结石预防治疗和抗肿瘤等方面亦能发挥有效地作用[13]。当前，人们对红曲霉发酵产生的莫纳可林K等研究还处于初级阶段，利用红曲霉规模化生产莫纳可林K的同时有效降低桔霉素含量，需要在优势菌株筛选方面取得进一步突破[14-15]。下一步，将通过物理、化学诱变、原生质体融合等手段，对筛选出的M8红曲菌株进行菌种改良，为低桔霉素、高比例莫纳可林K红曲工艺的开发和应用奠定基础。

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