高效液相色谱测定儿童体内霉酚酸血药浓度

许泽君，孙芳，景霞

吗替麦考酚酯在1995 年被美国食品和药品管理局批准应用于肾脏和心脏移植，并取得了良好的效果［1］。后来作为新型免疫抑制剂在临床应用广泛［2］。由于它的肾毒性较小［3-5］，常用于儿童肾病综合征等免疫缺陷疾病的治疗。吗替麦考酚酯进入体内之后，迅速水解成霉酚酸，发挥免疫作用。在病儿服药后，由于个体差异，在相同剂量下，霉酚酸的血药浓度相差较大［4］，因此，需要定期监测并及时调整服药剂量，提高临床疗效。目前霉酚酸的血药浓度测定方法主要包括免疫法、高效液相色谱法及液相-质谱联用法等［6-11］。其中高效液相色谱法较为经济、便捷，检测结果不受代谢物的影响。本研究建立了高效液相色谱法测定儿童血浆中霉酚酸的浓度，并以此监测肾病综合征病儿的血药浓度。虽然此法已有若干报道［12-15］，但这些报道均存在一些不足，有的方法使用缓冲盐溶液作为流动相，可能对仪器或色谱柱造成损伤；有的方法未选择内标或者内标存在着被其他药物干扰的可能；还有部分方法的血样处理过程相对复杂。本研究于2017 年11月至2018年4月建立的方法对这些问题加以改善，使高效液相色谱测定儿童血浆中霉酚酸的浓度更加简洁、方便。

1 材料

1.1 药品与试剂 霉酚酸标准品（纯度大于98%，Lot.086M4010V，SIGMA）；萘啶酸标准品（纯度99.0%，Lot107089，Dr.Ehrenstorfer）。甲醇、乙腈为色谱纯；纯化水由南京医科大学附属儿童医院自制。空白血浆由南京医科大学附属儿童医院提供。

1.2 仪器 Agilent 1260 Infinity 高效液相色谱仪（G1312B二元泵，G1316A柱温箱，G4212B二极管阵列检测器），十万分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo，MS205DU），Vortex-5 涡旋振荡器（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司），abbott 离心机（德国hettich公司）。

2 方法与结果

2.1 检测条件 色谱柱Agilent Eclipse Plus-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相为0.1%三乙胺溶液（用10%磷酸调节PH 为3.5±0.1）-乙腈＝60∶40；流速为1.0 mL/min；柱温为25oC；检测波长为215 nm，进样量为40 μL。

2.2 溶液的配制 对照品溶液：精密称取霉酚酸标准品12.5 mg，到25 mL 容量瓶加甲醇到刻度，然后超声震荡2 min。置于-30oC 冰箱内保存。内标溶液：精密称取萘啶酸标准品3.6 mg，到100 mL 容量瓶加甲醇到刻度，然后超声震荡2 min。置于-30oC冰箱内保存。

2.3 样品处理 精密吸取血浆样品200 μL 置于1.5 mL 离心管中，加入20 μL 内标，加入甲醇400 μL，涡旋震荡5 min 后，10 800 r/min 离心8 min，取全部上清液，加入5 μL 5%的磷酸水溶液，涡旋震荡1 min 后，10 800 r/min 离心8 min。吸取上清进样。

2.4 方法专属性试验 将空白血浆（不含内标），病儿服药后的血浆（含内标）按“2.3”处理后，在“2.1”色谱条件下，进样，得色谱图（图1）。可见血浆内源性物质的保留时间在3 min 左右，内标萘啶酸的保留时间在8.1 min 左右，主峰霉酚酸的保留时间在12.8 min左右，无杂质峰干扰，各个峰分离度及峰形良好，空白血样在霉酚酸和萘啶酸色谱峰位置无吸收。

图1 空白血浆（A）和病儿血浆（B）高效液相色谱图

2.5 标准曲线 取对照品溶液适量，用空白血浆等比稀释，配制成浓度为0.20，0.39，0.78，1.56，3.13，6.25，12.50，25.00，50.00 μg/mL 的系列血浆样品，按照“2.3”项下方法处理后进行测定。以对照品与内标的峰面积比（Y）和对照品浓度（X）作线性回归，得回归方程Y＝0.340 3X-0.003 6，r＝0.999 6。

2.6 方法回收率和精密度 配制0.39，25.00，50.00 μg/mL 高、中、低3种浓度的血浆样品，每一浓度1 d内按“2.3”项下方法平行操作5次；连续测定3 d。根据标准曲线，考察对照品的方法回收率及日内、日间精密度（表1）。

表1 回收率及精密度（n＝5）

2.7 生物样品的稳定性 考察霉酚酸0.39，25.00，50.00 μg/mL高、中、低3 种浓度的血浆样品在冻融1次，反复冻融3 次，室温放置12 h，4oC 冰箱内放置12 h，等不同温度条件下的稳定性。结果在各个条件下基本稳定（表2）。

2.8 病儿样本测定结果 根据已报道的有限采样法［16］，测定南京医科大学附属儿童医院病儿体内霉酚酸暴露量。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，病儿近亲属对研究方案签署知情同意书。病儿在服用吗替麦考酚酯分散片（赛可平）2周达稳态后，于清晨服药前（0 h），服药后0.5 h和2 h 3个时间点取静脉血1～2 mL于EDTA抗凝管，立即送实验室离心，取上清，按照上述的方法检测浓度。按0～12 h 药-时曲线下面积（AUC0～12h）＝7.75+6.49×C0+0.76×C0.5+2.43×C2计算。从2017年11月至2018 年4 月，6 个月内共检测177 例次。其中63 例12 h 内霉酚酸暴露量小于30 mg·L-1·h-1，占35.6%，102例在30～60 mg·L-1·h-1，占57.6%，12例大于60 mg·L-1·h-1，占6.8%。

3 讨论

3.1 试验方法 本研究处理血样时，采用了二倍体积的甲醇直接蛋白沉淀法，和其他常用的固相萃取法和液-液萃取法相比，该方法成本低，操作简便，花费时间较短，灵敏度也能满足临床样本测试的需求。然而，处理后发现上清有些许浑浊，对照品峰形较差，后优化方法，经磷酸酸化，离心后进样，可得到较澄清的上清液和较好的峰形。在流动相方面，我们没有使用缓冲盐体系，这样可以延长色谱柱寿命，简化流动相配制。选择萘啶酸作为内标的原因是它在当前的流动相条件下出峰时间适宜，不受其他杂质峰干扰。并且对儿童一般不会使用喹诺酮类药物，不会造成干扰。

3.2 检测结果 由于肝肠循环的存在，霉酚酸的谷浓度一般被认为不能很好地反映其在体内的暴露水平。但在一个用药间隔内多点采血会给病人，特别是儿童病人造成很大痛苦。因此，有限采样法［17］监测霉酚酸暴露量的方法被较多地采用。由于儿童病人的特殊性，本研究想在一个用药间隔内多点采血以建立有限采样法的估算公式较为困难，所以对住院病儿采用了上述三点采血法和相应的估算公式，预估他们体内的暴露药量。霉酚酸暴露量在肾病综合征中起最佳作用的范围尚无定论，按其在移植病人中能起最佳的免疫抑制作用［18］的范围30～60 mg·L-1·h-1来看，这些病儿有1/3 未能达标，另有6%超过上限，可能增加了不良反应发生的风险。

表2 血浆中霉酚酸稳定性分析（n＝5）

由于门诊清晨时需要采血的病人众多，门诊病人如果采3个血样，可能会造成采血时刻不准确，进而影响预估值的准确性。在统计已测样本的谷浓度和预估的霉酚酸暴露量之后（表3），我们发现，当谷浓度在＞1.0～3.5 μg/mL［19］之间时，病人霉酚酸暴露量是（42.1±11.4）mg·L-1·h-1，在靶范围30～60 mg·L-1·h-1之间占比为84%（77/92）。因此，为方便在门诊定期监测血药浓度的病人，可以选择监测谷浓度是否在＞1.0～3.5 μg/mL之间。如果谷浓度不在这个范围内，或者病人发生剂量调整时，我们会建议该病儿按有限采样法，估算更精确的霉酚酸暴露量。

表3 177例次样本谷浓度和预估的霉酚酸暴露量的统计分析

3.3 试验总结 本试验建立了霉酚酸血药浓度高效液相色谱测定方法。在本色谱条件下，霉酚酸的理论塔板数大于8 000，整个检测在15 min 左右完成，相关物质保留时间适当。该方法线性关系良好，重现性高，可用于医院病儿霉酚酸血药浓度的检测，为临床提供可靠的参考，保障合理和安全用药。但由于项目开展时间较短，经验不足和儿童群体的特殊性，还需进一步改进病儿霉酚酸暴露量的估算方法，并结合临床，探索霉酚酸暴露量在不同病种时更合理的范围。