蒙成药扎冲十三味丸对大鼠心脏的亚急性毒理学研究

强 欣，塔娜，韩 雪，张 娟，孙晓宇，张小芬，陶 春，奥·乌力吉

（1.内蒙古民族大学 医学院病理学教研室，内蒙古 通辽 028000；2.赤峰市医院司法鉴定所，内蒙古 赤峰 024000；3.内蒙古蒙医药工程技术研究院，内蒙古 通辽 028000）

蒙成药扎冲十三味丸早已被《药典》收录，是蒙医临床传统名贵药方之一.出自《至高要方》，由诃子、草乌（制）、禹粮土、麝香、珊瑚（制）、珍珠（制）、木香、石菖蒲、沉香、甘草、丁香、磁石（制）、肉豆蔻13种成份组方配伍而成［1］.临床治疗使用疗程长、范围广.检索国内外主流数据库至今未发现关于心脏毒理学研究方面的文献报道.本研究通过观察大鼠在用药后的一般情况、心率、心电图、生化指标、形态学及脏器系数方面的变化，探讨不同剂量时蒙成药扎冲十三味丸对心脏亚急性毒性作用，从而指导临床安全用药.

1 材料与方法

1.1 实验动物、药品、主要试剂和仪器

健康成年清洁级（Sprague-Dawley，SD）大鼠80只，雄性，体重（200±20）g.由《辽宁长生生物技术有限公司》提供，许可证号为《SCXK（辽）2015-0001》.蒙成药扎冲十三味丸由内蒙古蒙药股份有限公司生产，生药扎冲十三味由内蒙古民族大学附属医院生产，其余试剂均购买于索莱宝生物科技有限公司.CPA225D 型电子天平购置赛多利斯科学仪器有限公司，BL-420E+生物机能实验系统购置成都泰盟科技有限公司，MR-96A 型酶标仪和MW-12A 型洗板机购置深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，其余设备均来自德国徕卡公司.

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及记录资料

取80只SD大鼠分为正常对照组、蒙成药扎冲十三味丸中剂量组、蒙成药扎冲十三味丸高剂量组、生药扎冲十三味组等4组.实验前禁食12 h，后在恒温清洁房间内饲养2周，每天记录大鼠的基本情况.1.2.2 动物称重、给药剂量、药物配制方法、给药方法、喂养、观察及处死1.2.2.1 称重及计算动物给药剂量 将每只SD 大鼠使用电子天平进行体重测量，根据人民卫生出版社《药理实验方法学》［2］得出大鼠用药量约是成人用药量的6倍，但是前期预实验证实低剂量组无统计学意义，故本研究没有设计低剂量组.即：中剂量组用药量为0.432 g·kg-1，高剂量组（最大耐受量）为

10.80 g·kg-1，生药组剂量同于高剂量组，为10.80 g·kg-1.

1.2.2.2 药物配制方法 蒙成药扎冲十三味丸以蒸馏水配制研磨、溶解.生药组按照蒙成药扎冲十三味丸的组方称取生药1080 g，磨碎、混匀，用1000 mL蒸馏水溶解（剂量约1.08 g/mL），放入-20 ℃冰箱中保存备用.

1.2.2.3 给药方法 按大鼠体重计算药量，使用专业灌胃针每日定时对大鼠进行药物灌注一次，连续给药21天.将正常对照组以等同剂量蒸馏水进行灌胃.

1.2.2.4 喂养及观察 将SD大鼠在恒温清洁状态下进行饲养，每天定时喂食并观察一般情况、中毒反应及死亡情况.

1.2.2.5 处死 在第22天采取腹主动脉取血的方法将其处死.

1.3 心率和心电图的检测

灌胃给药后第21天采用10%的水合氯醛麻醉后，在大鼠的四肢分别插入一根注射针头，然后将导线与大鼠四肢连接后使用BL-420E+生物机能实验系统引导出导联心电图，观察大鼠心率和心电图的变化.

1.4 血清LDH、AST和α-HBDH的检测

提取血液离心后，取血清，采用Mindray MR-96A 酶标仪进行双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）检测.严格按照试剂及仪器设备说明书进行操作.在EXCEL工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应吸光度（OD）值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，并按曲线方程计算各样本浓度值.

1.5 组织病理学观察

心脏离体后迅速放入4%多聚甲醛固定液中进行固定，后常规制片、HE染色.光学显微镜观察组织结构及细胞形态的变化.

1.6 统计分析

实验数据应用SPSS 22.0统计软件进行统计学检验.对经正态性检验，服从正态分布的定量数据使用xˉ±s进行描述；各组样本均数进行t检验.P＜0.05表示具有统计学意义，P＜0.01表示存在显著差异.

2 结果

2.1 一般情况

各组大鼠在用药21天内出现不同的反应.见表1.

表1 各组大鼠一般情况Tab.1 General condition of rats in each group

2.2 心率及心电图

正常对照组及中剂量组大鼠心律齐，呈窦性心律，心率在每分钟320～500次之间，但中剂量组偶有ST段改变；高剂量组和生药组大鼠与正常对照组相比较，心率降低（P＜0.01），见表2，高剂量组大鼠心率在每分钟150～440次之间，心律不齐，心电图显示QRS波形提前出现，宽大畸形.生药组大鼠心律不齐，每分钟75～390次，心电图显示P波消失，QRS波形宽大畸形，五个以上室性期前收缩连续出现.

表2 各组大鼠的心率及LDH、AST、α-HBDH在各组的水平（xˉ±s）Tab.2 Heart rate and LDH，AST and α-HBDH levels in each group of rats（xˉ±s）

2.3 生化指标结果

2.3.1 血清乳酸脱氢酶（LDH）水平 与正常对照组血清LDH水平比较：中剂量组水平略有降低，无统计学意义（P＞0.05）；高剂量组及生药组水平均升高，均存在显著性差异（P＜0.01）.见表2.

2.3.2 血清谷草转氨酶（AST）水平 与正常对照组血清AST水平比较：中剂量组水平略有升高，但二者之间没有显著性差异（P＞0.05）；高剂量组及生药组水平均升高，具有显著性差异（P＜0.01）.见表2.

2.3.3 血清α-羟丁酸脱氢酶（α-HBDH）水平 与正常对照组血清α-HBDH水平比较：中剂量组、高剂量组及生药组水平均有所降低，且均存在显著性差异（P＜0.05）.见表2.

2.4 脏器系数

与正常对照组脏器系数相比较：中剂量组无显著性差异（P＞0.05）；高剂量组大鼠的心脏、肝脏和肾脏的脏器系数水平升高，均具有统计学意义（P＜0.05）；生药组大鼠的心脏、肝脏及肾脏的脏器系数均有不同程度的升高，均具有显著性差异（P＜0.01）.见表3.

表3 各组大鼠的脏器系数（xˉ±s）Tab.3 Organ coefficient of each group of rats（xˉ±s）

2.5 形态学观察

正常对照组及中剂量组心脏在细胞形态方面未见异常（图1，图2）.高剂量组部分横断心肌细胞质内可见粉染颗粒样物质，甚至形成空泡（图3）.生药组大部分心肌细胞肿胀，染色明显变浅，形成空泡状，甚至个别心肌细胞肌纤维溶解（图4）.

3 讨论

扎冲十三味丸中剂量组大鼠在用药21天后未出现中毒反应，心率、心电图正常，生化指标及细胞形态未见异常，说明中剂量安全可靠.高剂量组和生药组在用药21天后均出现一般中毒反应，且均出现心率降低、心律不齐和室性期前收缩等表现.有学者认为可能是由于制草乌炮制不当造成［3-4］，制草乌内含有剧毒成分乌头碱.有研究表明［5-6］，乌头碱中毒后由于副交感神经兴奋，可导致流涎增多；亦可出现唇舌及四肢发麻、言语困难、心律不齐等症状；心电图显示频发多源性期前收缩，室性心动过速及房室传导阻滞等变化.研究提示［7］，乌头碱对心脏的毒性作用机制可能是由于其直接作用于心脏后使心肌细胞膜上的Na+-K+ATP活性降低，Na+通道开放，Na+向内流动速度增加，使细胞内Na+浓度增加，K+浓度降低，促进细胞膜去极化，产生高频异位节律［8-9］.高剂量组和生药组大鼠的中毒反应、心率和心电图的改变符合乌头碱中毒的表现.

研究表明［10］，当病毒和细菌感染、中毒及肿瘤等造成心肌损害时，心肌细胞膜的通透性增强，LDH、AST易漏出到细胞外致使其水平升高.本研究中生药组和高剂量组检验结果均发现血清LDH、AST浓度水平升高，中剂量组血清LDH 水平未见明显改变.王永田等［11-12］发现药物中毒后，LDH、α-HBDH、CK、CKMB 及AST 的检测可以作为确诊心肌损伤的重要方法.本研究中剂量组、高剂量组及生药组血清α-HBDH水平均不同程度降低，理论上讲，细胞损伤后，酶原大量释放，α-HBDH水平应该上升，本研究中各组血清α-HBDH水平均降低，这与Preus M［13］的研究结果相一致，α-HBDH降低机制尚不清楚，需要进一步研究探讨.

脏器系数是动物实验中重要的观察指标，其变化可反映毒物对该脏器的毒性综合作用，从而帮助对内脏器官的功能状态和病变的性质等进行判断.脏器系数升高常表明脏器发生增生、水肿等病理改变，其降低常提示脏器萎缩或退行性等病理改变［14］.生药组和高剂量组大鼠心脏的脏器系数均增大，组织学观察主要因为心肌细胞发生了水肿等改变引起.目前，扎冲十三味丸中毒对心脏损害的机制尚不明确，有学者认为，当心脏缺血或缺氧时，心肌细胞内缺氧、代谢产物的蓄积和跨膜蛋白功能的丧失可导致心肌水肿等损伤.

通过心率、心电图、生化指标及形态学观察等指标结果显示，其中生药组的毒性要重于蒙成药；故认为制草乌等炮制不规范导致生药组中乌头碱含量过高，所以在一定程度上可能与心肌组织中乌头碱含量有关.