海洋红酵母菌和枯草芽孢杆菌对蛋雏鸡生长性能、肠道形态和免疫功能的影响

李玲茜，惠俊楠，吴 旻，兰海楠，郑 鑫

（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118）

益生菌作为饲料添加剂，因其具有无残留、无抗药性、不污染环境、提高动物生长等优点[1]成为当前研究重点，并广泛应用于家禽生产中，主要包括乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌和肠球菌等类别。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，BS）为革兰氏阳性需氧菌，以孢子状态存在，其孢子对苛刻条件的抵抗力强，环境温度下可长期储存[2]。枯草芽孢杆菌通过胃酸环境后能维持良好活性，并抵达动物肠道发挥功效[3]。枯草芽孢杆菌单独或复合添加均具有改善肠道菌群、增强免疫功能、促生长等功效[1,4-5]。

海洋红酵母菌（Rhodotorula benthica）是自然界普遍存在的单细胞酵母品系，也是一类抗逆性较强的腐生菌[6]。海洋红酵母菌富含多种活性物质和营养因子，培养可产生多种类胡萝卜素，是具有潜力的动物饲料添加剂和天然色素源[7-8]，能够刺激宿主消化道内有益菌的生长繁殖，改善宿主的生产机能和健康状态，提高养分吸收率和抗氧化能力[4]。然而，海洋红酵母菌多应用于水产研究。Wang等[9]研究证明，饲粮中添加芽孢杆菌和胶红酵母能改善幼年大西洋鲑的生长性能和抗病能力。Wang等[7]研究表明，饲粮中添加海洋红酵母能提高凡纳对虾的生长性能和抗氧化能力。但枯草芽孢杆菌和海洋红酵母菌复合使用对蛋雏鸡的影响研究较少。为此，本试验旨在探究枯草芽孢杆菌和海洋红酵母菌单独和联合使用对海兰褐蛋雏鸡生长性能、肠道形态以及免疫功能的影响，为复合益生菌制剂在蛋雏鸡养殖生产中的合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 1.6×108CFU/kg海洋红酵母菌、6.7×1010CFU/kg枯草芽孢杆菌由吉林省农科院提供，复合益生菌由吉林农业大学动物遗传育种与繁殖实验室自制（本试验经预处理后确定添加量）。试验用海兰褐蛋雏鸡及基础饲粮由扶余禾丰公司提供。

1.2 试验设计与饲养管理 选取体重（38.41±0.1）g的1日龄海兰褐蛋雏鸡396只，随机分为4组，每组3个重复，每个重复33只。对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮中添加的活菌数分别为1×108CFU/kg海洋红酵母菌、1×1010CFU/kg枯草芽孢杆菌和复合益生菌（1×108CFU/kg海洋红酵母菌+1×1010CFU/kg枯草芽孢杆菌）。采用3层笼养方式，试验期28 d。基础饲粮参照NRC（1994），并结合《鸡饲养标准》（NY/T 33 2004）配制见表1。试验期间自由采食，饮水充足，日常鸡舍管理方案和相关免疫程序依照扶余禾丰公司育雏鸡场规范实行。

表1 基础饲料组成及营养成分（风干基础）

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生长性能 于试验第1、7、14、21、28天08:00空腹称重。称重前一天20:00断料，饮水自由。试验期间准确记录投料量，每周以各重复为单位统计体重、余料量（采用精度为0.1 g的电子秤称量），记录平均日增重、平均日采食量、耗料增重比。

1.3.2 肠道形态 于试验第28天，每组挑选9只蛋雏鸡颈静脉采血，屠宰后取出完整肠道，分离取十二指肠、空肠和回肠（约5 cm），0.9%生理盐水冲洗，4%多聚甲醛固定。组织块经常规石蜡包埋、切片，苏木精-伊红（HE）染色和封片，OLYMPUS-CX31生物显微镜下观察肠道形态结构，挑选多个非连续性视野观察切片，将典型视野拍照保存，测量绒毛高度和隐窝深度，计算绒腺比。

1.3.3 血清免疫球蛋白 于试验第28天，每组挑选9只蛋雏鸡颈静脉采血，收集的全血静置30 min后3 000 r/min离心15 min，分离的血清于-20℃保存备用。采用购于酶免有限公司的ELISA试剂盒测定血清中IgA、IgG和IgM含量。

1.3.4 肠黏膜免疫因子 于试验第28天，每组挑选9只蛋雏鸡屠宰后取出完整肠道，分离出空肠，0.9%生理盐水冲洗内容物后载玻片刮取黏膜，-80℃保存备用。荧光定量PCR检测各组空肠黏膜TNF-α、IL-2、IL-4及IL-6mRNA的相对表达量，以β-肌动蛋白（β-actin）作内标，采用2-△△CT法计算。cDNA逆转录试剂盒购于美国GeneCoPoeia公司，SYBR Premix Ex TaqTM购于日本TaKaRa公司，引物由上海生物工程技术有限公司合成，引物序列见表2。

表2 基因引物序列

1.4 统计分析 采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），运用Duncan´s法进行多重比较，结果用平均值±标准误表示，以P＜0.05判断差异显著性。

2 结果

2.1 海洋红酵母菌和枯草芽孢杆菌对蛋雏鸡生长性能的影响 由表3可知，各组蛋雏鸡在试验1～14日龄的平均日采食量、平均日增重和耗料增重比无显著差异；在15～28日龄阶段，复合益生菌组的平均日增重高于对照组（P＜0.05），耗料增重比低于对照组（P＜0.05），枯草芽孢杆菌组的平均日增重高于对照组（P＜0.05）；在1～28日龄阶段，复合益生菌组的平均日增重高于对照组（P＜0.05）。

2.2 海洋红酵母菌和枯草芽孢杆菌对蛋雏鸡肠道形态的影响 由表4可知，与对照组比，添加复合益生菌能提高十二指肠绒毛高度和绒腺比（P＜0.05），且各试验组有降低隐窝深度的趋势（P＞0.05）；复合益生菌组蛋雏鸡空肠绒毛高度及绒腺比提高（P＜0.05），而添加枯草芽孢杆菌仅提高了空肠绒毛高度（P＜0.05），各试验组有降低隐窝深度的趋势（P＞0.05）；各试验组均能改善回肠的绒毛高度和绒腺比，并降低隐窝深度（P＞0.05）。由图1可以看出，各组肠绒毛完整性良好，绒毛排列整齐。

2.3 海洋红酵母菌和枯草芽孢杆菌对蛋雏鸡血清免疫球蛋白的影响 由表5可知，复合益生菌组血清IgA含量高于对照组（P＜0.05）；复合益生菌组血清IgG含量高于对照组和海洋红酵母组（P＜0.05）；各组血清IgM含量无显著差异。

2.4 海洋红酵母菌和枯草芽孢杆菌对蛋雏鸡肠道免疫因子的影响 由图2可知，各组空肠TNF-αmRNA相对表达量无显著差异。与对照组比，各试验组空肠IL-2mRNA相对表达量均有提高趋势（P＞0.05）；海洋红酵母组和复合益生菌组空肠IL-4mRNA相对表达量提高（P＜0.05），试验组间差异不显著；枯草芽孢杆菌组和复合益生菌组提高空肠IL-6mRNA相对表达量（P＜0.05），试验组间差异不显著。

3 讨 论

3.1 海洋红酵母菌和枯草芽孢杆菌对蛋雏鸡生长性能的影响 益生菌随饲粮进入消化道后，能够维持肠道菌群平衡，促进有益菌生长，还能降低有毒物质的积累[4]。此外，益生菌产生的多种酶类和营养物质，促进消化并提高养分吸收比，可改善机体的生长性能[10]。本试验中，与对照组相比，枯草芽孢杆菌组蛋雏鸡15～28日龄平均日增重提高，复合益生菌组15～28日龄和1～28日龄的平均日增重显著提高，15～28日龄的耗料增重比显著降低。余东游等[5]研究发现，饲粮中添加枯草芽孢杆菌提高了罗斯308肉鸡1～42日龄的平均日增重，主要通过22～42日龄平均日增重体现出来。陆银等[11]研究发现，复合益生菌对1～21日龄和1～35日龄的肉鸡生长性能无显著作用，但能提高21～35日龄试验组的生长性能。这与本试验结果一致。益生菌的添加对前期作用不显著，这可能是因为蛋雏鸡早期肠道功能体系尚未完善，益生菌在胃肠道中增殖、发挥功效需要一定时间。Yeo等[12]认为，益生菌对肉鸡的促生长作用体现在饲养前期，在饲养后期和全期未发现显著促生长效果，这可能是所用鸡的品种、菌株、饲喂方式、饲养环境不同带来的差异。

表3 海洋红酵母菌和枯草芽孢杆菌对蛋雏鸡生长性能的影响

表4 海洋红酵母菌和枯草芽孢杆菌对蛋雏鸡小肠道形态的影响

表5 海洋红酵母菌和枯草芽孢杆菌对蛋雏鸡免疫球蛋白的影响

3.2 海洋红酵母菌和枯草芽孢杆菌对蛋雏鸡肠道形态的影响 小肠在营养物质的消化、吸收和转运方面起主要作用[13]，是机体抵御有害物质和病原微生物的保护屏障，良好且完整的肠道形态是维持机体健康生长的重要保障[14]。小肠绒毛高度增加，食糜吸收面积增大，吸收能力增加；隐窝变浅，成熟细胞数量增加，消化能力随之加强。绒腺比综合反映小肠的功能状况，比值升高，表明小肠消化吸收功能增强，肠道结构改善。Sen等[2]研究表明，饲粮中添加枯草芽孢杆菌LS可改善十二指肠和回肠中绒毛高度及绒腺比，改善肠道结构。Aliakbarpour等[15]研究发现，饲粮中添加益生菌可提高空肠绒毛高度及粘蛋白基因的表达。本试验表明，与对照组比，基础饲粮中添加复合益生菌能有效提高十二指肠和空肠的绒毛高度及绒腺相比，降低隐窝深度，对回肠影响不显著。

益生菌随饲粮进入消化道后，能提高机体多种酶类物质的活性，富含多种活性代谢产物[4,16]，便于机体消化和利用饲粮中的营养物质，促进肠道黏膜发育。此外，益生菌能改善肠道黏液分泌，增强上皮细胞的紧密连接，调节肠道上皮细胞增殖与分化，修复受损肠道[14]。最后，益生菌通过消耗肠道内的氧气促进厌氧菌的生长，而枯草芽孢杆菌能产生多种抗菌肽[5]等代谢产物并激活酸性蛋白酶活性[10]、海洋红酵母菌细胞壁的活性成分甘露寡糖[17]为病原菌提供附着源，共同抑制病原菌的繁殖，减少对肠黏膜的损伤，改善肠道黏膜形态结构。

3.3 海洋红酵母菌和枯草芽孢杆菌对蛋雏鸡血清免疫球蛋白的影响 血清免疫球蛋白含量是体现动物机体免疫功能的重要标志。IgG在体液免疫中发挥作用，具有抗细菌、病毒和外毒素等活性功能。IgM是机体受抗原刺激后最先产生的抗体，在感染早期起主要的免疫作用。血清型IgA含量较低，分泌型IgA参与黏膜局部免疫，在局部抗感染中发挥作用。余东游等[5]研究指出，饲粮中添加枯草芽孢杆菌能显著提高肉鸡血清中IgG含量及免疫器官指数，通过提高肉鸡的免疫功能而改善其生长性能。Vinderola等[18]报道，芽孢菌能促进小鼠B细胞增殖和sIgA的分泌，提高免疫水平。本试验结果表明，基础饲粮中添加益生菌可以提高蛋雏鸡血清IgG、IgA含量，其中复合益生菌组效果最好。原因可能是，海洋红酵母细胞壁所含的甘露寡糖和葡聚糖具有刺激细胞和体液免疫的作用[6]，芽孢杆菌的菌体成分（如胞壁糖、肽聚糖和多肽等）可作为抗原刺激肠道作用于机体免疫系统，调节免疫器官的生长发育[5]。并且益生菌在消化道内大量繁殖，代谢过程中产生多种营养因子[16]，也可作用于机体免疫系统。

3.4 海洋红酵母菌和枯草芽孢杆菌对蛋雏鸡肠黏膜免疫因子的影响 IL-2由活化的CD4+T细胞及CD8+T细胞产生，具有广泛的生物活性，是调控免疫应答的重要因子；IL-4由II型辅助T细胞分泌，其主要功能是刺激B细胞活化和T细胞增殖，在调节体液免疫和获得性免疫中起关键作用；IL-6 由单核细胞、T和B淋巴细胞、成纤维细胞等产生，能使B淋巴细胞分化为成熟的浆细胞。IL-2、IL-4、IL-6的分泌细胞主要分布在肠黏膜固有层，在免疫应答的反应阶段，促进T、B细胞的活化、增殖与分化。TNF-α主要由活化的单核细胞或巨噬细胞产生，能杀伤和抑制肿瘤细胞、抗感染等。益生菌刺激某些免疫相关细胞因子产生的研究已有报道。曹晋宜等[19]研究发现，给小鼠连续15 d灌胃瑞士乳杆菌，其小肠IL-2、IL-4、IL-6 含量显著增加。李云锋等[20]研究表明，饲粮中添加枯草芽孢杆菌能促进仔猪十二指肠IL-6和TNF-α以及回肠IL-1mRNA相对表达量，证明了芽孢杆菌本身可以刺激小肠黏膜免疫因子的表达。本试验研究表明，基础饲粮中添加复合益生菌能上调IL-4和IL-6mRNA相对表达量，提高了空肠黏膜免疫因子的表达。这可能是由于枯草芽孢杆菌在动物肠道内萌发繁殖，能黏附在小肠黏膜表面，激发免疫反应[21-23]，促使巨噬细胞和B、T 淋巴细胞释放免疫因子，由淋巴细胞途径激活机体免疫体系，提高动物的免疫功能[4]。海洋红酵母细胞壁的活性成分具有刺激细胞和体液免疫的作用[6]，葡聚糖可以增强巨噬细胞和嗜中性粒细胞的迁移和吞噬[24]，提高动物抵抗病原的能力[25]。复合益生菌共同作用于小肠，刺激机体内巨噬细胞的活化和数量的增多，有利于增强机体的免疫功能。

4 结 论

本试验条件下，添加复合益生菌可有效提高蛋雏鸡生长性能、改善肠道形态、增加血清免疫球蛋白含量及空肠黏膜免疫因子mRNA相对表达量。