人参归脾丸对脾不统血证大鼠肝损伤的保护作用及其机制*

王 丹， 高 峰， 陈 慧， 项伟玲， 骆志显， 金丽琴△

(1. 温州医科大学检验医学院、生命科学学院， 浙江 温州 325035； 2. 浙江省人民医院， 杭州 310014； 3. 杭州医学院， 浙江 杭州 310053)

脾不统血证是指脾气亏损导致脾不能统摄血液所表现的证候，脾具有统摄血液的功能，脾气虚则统血无权，血离经妄行，从而导致出血，脾不统血证是脾气虚导致的慢性出血症状[1]。临床表现为便血、尿血、肌衄、齿衄，妇女可见月经过多、崩漏等，常伴有眩晕、神疲乏力、少气懒言、食少便溏等症[2]。人参归脾丸具有益气补血，健脾养心的功效，主要用于气血不足、心悸、失眠、食少乏力、面色萎黄和月经量少。现代研究表明，脾不统血状态下，肝脏功能受损，线粒体自噬机制紊乱，受损的线粒体不能及时清除[3, 4]，导致活性氧上升或者细胞凋亡因子释放[5]，从而造成细胞损伤或细胞凋亡[6-9]，归脾汤可以有效改善脾虚症状，为脾不统血证的研究提供了方向[10-12]。本实验通过观察人参归脾丸对脾不统血证大鼠的治疗效果及其对肝脏的影响，从细胞凋亡方面，探讨人参归脾丸对脾不统血证大鼠的作用机理，为临床“与脾相关”证候的治疗提供现代生物学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠40只，周龄7～8周，250～300g,购自苏州昭衍试验动物责任有限公司，动物合格证号：SCXK(苏)2018-0006。

1.2 实验仪器及试剂

全自动生化分析仪(迈瑞医疗公司)，血细胞分析仪(迈瑞医疗公司)，NANO DROP 20000核酸蛋白分析仪(Thermo), S1000TM Thermal Cycler PCR仪(BIO-RAD)，CFX Connect TM荧光定量PCR仪(BIO-RAD),电泳仪(BIO-RAD),紫外分光光度计(Thermo)，冷冻高速离心机 (Thermo Fisher)，金属浴(天根生化科技有限公司)、蛋白凝胶成像系统(BIO-RAD)。人参归脾丸(北京同仁堂股份有限公司)，低分子肝素钙(江苏大同盟制药有限公司)，RIPA裂解液(碧云天)，BCA蛋白浓度检测试剂盒(Thermo),大鼠IL-6和TNF-α的ELISA试剂盒(购自杭州联科生物技术股份有限公司)；RNA逆转录试剂盒(Takala),SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Takala),兔抗Bcl-2多克隆抗体、兔抗Bax多克隆抗体均由杭州华安生物技术有限公司提供。鼠抗Actin、兔抗caspase3均购自Abcam，一抗稀释液(碧云天)，ECL化学发光试剂盒(Thermo), 水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 大鼠模型建立及分组处理

造模方法参照参考文献[10]，40只SPF级雄性SD大鼠，经适应性喂养1周后随机分为正常对照组(NC)10只和实验组30只，前42 d，实验组每日游泳30 min，同时禁食2 d，饮食1 d(饮食失节)，大鼠出现饮食减少、体重减轻、大便溏塞、体温下降等症状；第43～72日，实验组在游泳力竭、饮食失节的基础上，每日皮下注射低分子肝素钙溶液(1 000 IU/ml,0.2 ml/100 g)，实验组大鼠出现不可逆的皮下出血与便潜血症状，即成功构建脾不统血证大鼠模型，随后将实验组分为模型组(MD)、自然复健组(NR)和归脾丸组(GP)；第73～102日，模型组继续施加处理因素(游泳力竭、饮食失节及注射低分子肝素钙)，自然复健组和归脾丸组停止施加处理因素，归脾丸组每日灌胃人参归脾丸溶液(归脾丸加48 ml生理盐水制成人参归脾丸溶液，浓度为0.2 g/ml，10 ml/(kg·d))，自然复健组灌胃等量生理盐水。

1.4 实验大鼠血与肝脏样本的采集

第102日后禁食8 h，4%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取部分血，放入EDTA抗凝真空管中，用于红细胞数量、血红蛋白含量及红细胞压积的测定；取部分血分离血清，用于肝功能指标和细胞因子的测定；取肝脏，观察肝脏颜色、大小及光滑度，部分放在液氮中速冻后置于-80℃冰箱中保存，用于Bcl-2、Bax、Caspase3等蛋白和mRNA的相对表达水平的检测。

1.5 大鼠血清肝功能指标的测定

采用全自动生化分析仪测定肝功能指标，包括丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)活性、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)活性、总胆红素(total bilirubin，TBil)和总蛋白(total protein，TP)的含量。

1.6 大鼠红细胞数量、血红蛋白含量及红细胞压积的测定

采用全自动血细胞分析仪测定血细胞指标，包括红细胞数量(erythrocyte count)、血红蛋白含量(hemoglobin content)和红细胞压积(hematocrit)。

1.7 大鼠血清IL-6、TNF- 蛋白含量的测定

1.8 肝组织中Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白的相对表达水平

通过RIPA裂解缓冲液裂解大鼠肝组织，使用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度。制备12%分离胶与5%浓缩胶，上样等量的蛋白质，采用BIO-RAD电泳仪进行SDS-PAGE凝胶电泳，通过湿转(300 mA,70 min)转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2h，Actin一抗(1∶3 000稀释)、Bcl-2一抗(1∶1 000稀释)、Bax一抗(1∶1 000稀释)、Caspase3一抗(1∶1 000稀释)4℃孵育过夜，二抗孵育1h,加入ECL发光试剂，使用蛋白凝胶成像系统显影，经ImageJ软件进行灰度分析，计算蛋白相对表达水平。

1.9 肝组织中Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA的相对表达水平

采用酚-氯仿一步法提取大鼠肝组织总RNA，用逆转录试剂盒逆转录为cDNA，加入相应的引物配制荧光定量反应体系20 μl，通过实时荧光定量PCR测定Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA的表达量。结果用2-△△Ct表示，即△Ct = Ct值(目的基因)- Ct值(内参基因)；△△Ct =△Ct值(实验组)-△Ct值(对照组)。引物均由杭州尚亚生物合成，各基因引物序列见下表1。

Tab. 1 Reverse transcription primer sequences and primer length of each gene

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠血清肝功能指标的检测

与正常对照组相比，模型组、自然复健组和归脾丸组血清ALT活性、AST活性和TBil含量均显著升高(P<0.01)，TP含量显著降低(P<0.01))；与模型组相比，自然复健组和归脾丸组血清ALT活性、AST活性和TBil含量均明显降低，TP含量明显升高(P<0.01)；与自然复健组相比，归脾丸组血清ALT和AST活性均明显降低(P<0.01)，TP含量明显升高(P<0.01，表2)。

Tab. 2 Comparison of liver function indexes in four groups of rats n=10)

2.2 大鼠红细胞数量、血红蛋白含量及红细胞压积的检测

与正常对照组相比，模型组、自然复健组和归脾丸组血RBC、HGB和HCT含量均显著降低(P< 0.01)；与模型组相比，自然复健组血RBC、HGB和HCT含量均显著升高(P<0.05)；与自然复健组相比，归脾丸组血RBC数量明显升高(P<0.05)，HGB和HCT含量的差异无统计学意义(P>0.05，表3)。

Tab. 3 Comparison of red blood cell count, hemoglobin content and hematocrit in four groups of n=10)

2.3 大鼠血清IL-6、TNF- 含量的测定

与正常组比较，模型组大鼠血清中IL-6和TNF-α含量均升高(P<0.05)；与模型组相比，自然复健组大鼠血清中IL-6含量降低(P<0.05)， TNF-α含量的变化无统计学意义(P>0.05)，归脾丸组大鼠血清中IL-6和TNF-α含量均降低(P<0.05)；与自然复健组相比，归脾丸组IL-6和TNF-α含量虽减少，但是无统计学意义(P>0.05，表4)。

Tab. 4 Comparison of serum IL-6 and TNF-α pro-inflammatory cytokine levels in the four groups of rats (pg/ml， n=10)

2.4 大鼠肝组织中Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白的相对表达水平

与正常组比较，模型组大鼠肝组织中Bcl-2蛋白水平明显降低(P<0.01)，Bax和Caspase3蛋白水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，自然复健组大鼠Bax和Caspase3蛋白水平明显降低(P<0.05)，归脾丸组大鼠肝组织Bcl-2蛋白水平升高(P< 0.05)，Bax和Caspase3蛋白水平明显降低(P< 0.05)；与自然复健组相比，归脾丸组大鼠肝组织Bcl-2蛋白水平显著升高，Caspase3蛋白水平明显降低(P<0.05，表5)。

Tab. 5 Comparison of apoptosis-related protein expressions in the four groups of rats n=10)

2.5 大鼠肝组织中Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA的相对表达水平

与正常组比较，模型组大鼠肝组织中Bcl-2 mRNA水平明显降低(P<0.01), Bax和Caspase3 mRNA水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，自然复健组大鼠肝组织Caspase3 mRNA水平显著降低(P<0.05)，归脾丸组大鼠肝组织Bcl-2 mRNA水平明显升高(P<0.05)，Bax和Caspase3 mRNA水平显著降低(P<0.05)；与自然复健组相比，归脾丸组Bcl-2 mRNA水平明显升高，Bax mRNA水平明显降低(P<0.05，表6)。

Tab. 6 Comparison of apoptosis-related protein mRNA expressions in the four groups of rats n=10)

3 讨论

脾不统血证是在脾气虚的基础上发展而来，以脾气虚和出血为辩证要点。脾气虚弱，气血虚亏，固摄无力，不能摄血，从而导致血液逸出经脉，出现各种出血症状。本实验采用多因素造模法-游泳力竭、饮食失节和皮下注射低分子肝素钙溶液构建脾不统血证大鼠模型。实验组大鼠出现大便搪塞、食欲不振、神疲乏力、皮毛稀疏、毛色晦暗和皮下出血等体征，说明已成功构建脾不统血证大鼠模型。已有文献报道，该模型安全性高且死亡率低，更适用于脾不统血证动物学研究[13, 14]。

细胞凋亡是肝病发病机理中的主要特征，干预肝细胞凋亡可以延迟疾病进展并降低肝病的发病率。肝脏中的细胞死亡主要通过细胞凋亡或坏死发生，细胞凋亡也是消除受损或感染细胞并维持组织稳态的生理途径，细胞凋亡通路中，Bcl-2抑制凋亡，而Bax促进凋亡[15, 16]。自噬会影响线粒体循环，从而可以通过线粒体途径，调节肝细胞凋亡[17-19]。肝脏损伤后，血清肝功能指标异常，胆汁代谢紊乱，合成功能受损,观察血清中肝功能指标，可以评估肝脏的功能基本状况[20]，根据红细胞数量、血红蛋白含量和红细胞压积的变化，可以评估药物的治疗作用。

该实验以脾不统血证大鼠作为研究对象，给予人参归脾丸治疗，通过观察大鼠血清肝功能生化指标，血红细胞数量、血红蛋白含量和红细胞压积，细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表达以及mRNA的表达，探究人参归脾丸对脾不统血证大鼠的保护作用。大鼠血清肝功能指标可以反映肝脏是否损伤，血细胞检查可以反映人参归脾丸对脾不统血证大鼠是否有保护作用。人参归脾丸治疗后，大鼠便潜血症状缓解，饮食趋于正常，体重进行性增加，行动较模型组增多，皮毛茂密、有光泽。与模型组相比，血清肝功结果显示， AST、ALT和TBil水平相对降低，TP水平相对升高；血细胞结果显示，红细胞数量、血红蛋白含量和红细胞压积均相对增加；ELISA结果显示，大鼠血清中IL-6和TNF-α蛋白含量均明显降低;大鼠肝组织抗凋亡蛋白Bcl-2水平相对升高、促凋亡蛋白Bax和Caspase3水平均相对降低；大鼠肝组织Bcl-2 mRNA 水平相对增加、Bax和Caspase3 mRNA 水平均相对降低。上述结果表明，脾不统血状态下，大鼠肝脏受到明显损伤，导致炎症因子、凋亡相关因子释放，加剧了细胞凋亡。人参归脾丸可以通过下调血清AST、ALT和TBil水平，上调血清TP、血中红细胞数量、血红蛋白含量和红细胞压积，下调IL-6和TNF-α蛋白含量；上调肝组织抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-2 mRNA水平，下调促凋亡蛋白Bax和Caspase3 蛋白及mRNA水平来减少凋亡相关因子的释放，并降低促炎细胞因子水平，减少细胞凋亡,从而保护大鼠肝脏。归脾丸组治疗效果较自然复健组好，人参归脾丸益气补血，可以改善脾不统血症状，有效减少细胞凋亡，从而起到保护作用。

综上所述，人参归脾丸可以减少凋亡相关因子的释放，增强抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，抑制促凋亡因子Bax和Caspase3的表达，抑制炎症细胞因子的释放，改善肝组织细胞凋亡状况，从而对脾不统血证大鼠起到一定的保护作用，起到一定的参考作用，进而指导临床用药。