多配体蛋白多糖-1在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺上皮间质转化中的作用及机制*

金 艳， 刘文明

(1. 南京医科大学附属常州第二人民医院急诊内科， 2. 重症监护室， 江苏 常州 213000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种常见的呼吸系统疾病，可引起肺脏及肺外脏器功能受损及代谢紊乱，是全球范围内发病率和死亡率最高的疾病之一[1]。虽然COPD的发病机制尚不清楚，但有研究发现，上皮-间质转化(EMT)参与多种肺部疾病的发病机制，包括发育障碍、纤维化、组织重塑及肺癌[2]。多配体蛋白多糖-1(syndecan-1)是一种细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖，作为细胞外基质受体参与细胞-细胞和细胞基质粘附[3]。最新研究发现，syndecan-1在COPD患者血清中呈下降趋势，且与小气道阻塞参数呈正相关，与C反应蛋白呈负相关[4]。由此推测，syndecan-1在COPD模型大鼠肺组织中表达降低，而过表达syndecan-1后可改善肺组织损伤。因此，本研究通过转染携带大鼠syndecan-1基因的重组腺病毒载体，上调Syndecan-1基因的表达，探讨过表达syndecan-1在COPD大鼠肺EMT中的作用及机制研究，为临床治疗COPD提供新的靶点及实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 选择清洁级SD雄性大鼠30只，8～12周，体重200～240 g，购自中国科学院昆明动物研究所，合格证号：SCXK(滇)K2016-0001。

1.1.2 实验主要试剂 DAB显色试剂盒(碧云天生物科技有限公司)；Trizol(Invitrogen公司)；vimentin、E-cadherin、TGF-β1、Smad2/3、GAPDH普通PCR上下游引物(上海生工公司)；TGF-β1单克隆抗体、Smad2/3单克隆抗体、p-Smad2/3多克隆抗体、山羊抗兔二抗(美国Abcam公司)；iBright FL1500智能成像系统(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 实验动物的分组与模型制备

将大鼠按随机数字表法分为假手术组、COPD大鼠模型组和COPD+syndecan-1过表达组，每组10只。根据参考文献[5]，采用烟熏联合气管注射脂多糖建立COPD大鼠模型，适应性饲养1周后，大鼠于造模第1、14日予腹腔内注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，将大鼠仰卧位固定于鼠板上，暴露气管，注射脂多糖200 μg/200 μl(1 mg/ml)后缝合皮肤，切口消毒，待大鼠清醒后放回原鼠盒中饲养。假手术组暴露气管后注射等量的生理盐水。

COPD组于术后第2～13、15～28日，每天上、下午置于烟熏箱内被动吸烟处理，每次0.5 h，共30 d，2次烟熏间隔时间大于或等于5 h，间隔期记录大鼠摄食、排便、活动等状态数据。假手术组继续正常饲养30 d。模型建立完成后转染100 μl携带大鼠syndecan-1基因的重组腺病毒载体Ad-CMV-GFP-SDC1，为syndecan-1过表达组，COPD组转染100 μl空载病毒，假手术组不作处理。

1.3 标本采集

连续处理2周后将各组大鼠麻醉，暴露器官进行肺功能检测；检测结束后取肺组织，将右肺下叶用10%中性甲醛固定，并进行石蜡包埋，用于HE病理学检测和免疫组化检测；取右肺中叶用0.9%冷生理盐水，充分研磨制成10%肺组织匀浆，3 000 r/min，4℃离心10 min，取上清，用于qRT-PCR检测；剩余肺组织保存至-80℃冰箱，用于Western blot检测。

1.4 观察指标

1.4.1 大鼠肺功能检测 处理结束24 h后，各组大鼠分别麻醉后将Y型插管插入气管，Y型另两端分别与流速传感器、压力传感器连接，流速传感器与小动物呼吸器连接。分别检测每分钟呼气量(VE)、最大呼气流量(PEF)和0.3 s用力呼气容积(FEV0.3)。

1.4.2 大鼠气道肺组织病理学的HE检测 麻醉取右肺下叶标本，用10%中性甲醛固定24 h，乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、苏木精染色、切片。于光镜下观察大鼠肺组织病理学变化。

1.4.3 大鼠肺组织syndecan-1、vimentin、E-cadherin表达的免疫组化检测 将石蜡包埋好的组织行4 μm连续切片，60℃烤箱中烘烤3～4 h；二甲苯溶液脱蜡3次，每次15 min，梯度乙醇逐步水化，每次3 min；PBS清洗后将切片置于柠檬酸盐缓冲液高压修复10 min，清洗；3%过氧化氢甲醇溶液封闭10 min，清洗；加山羊血清后静置15 min后滴加一抗，4℃孵育过夜；37℃下复温30 min，清洗；滴加二抗孵育15 min，清洗滴加二氨基联苯胺后观察染色情况；苏木素染色，中性树胶进行封片，显微镜下观察syndecan-1、vimentin、E-cadherin蛋白阳性表达情况。

1.4.4 大鼠肺组织TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3蛋白表达的Western blot检测 取肺脏组织加入预冷的RIPA裂解液，冰浴放置30 min，提取总蛋白并进行定量。进行10%SDS-PAGE电泳，将蛋白条带转移至PVDF膜上，分别一抗(1∶2 000稀释)的脱脂牛奶中4℃过夜。洗膜后加入二抗室温孵育1 h，洗膜，取适量ECL试剂显影5 min，采用iBright FL1500智能成像系统进行定量分析。

1.4.5 大鼠肺组织vimentin、E-cadherin、TGF-β1和Smad2/3 mRNA表达水平的qRT-PCR检测 取肺组织匀浆加入1 ml Trizol提取肺组织总RNA，并将RNA反转录为cDNA，采用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测肺组织vimentin、E-cadherin、TGF-β1和Smad2/3 mRNA表达水平。引物设计如下：vimentin上游5'-CTCTCAAAGATGCCCAGGAG-3'，下游5'-GCACGATCCAACTCTTCCTC-3'；E-cadherin上游5'-TGGACAGGGAGGATTTTGAG-3'，下游5'-ACCTGAGGCTTTGGATTCCT-3’；TGF-β1上游5'-CGGAGTTGTGCGGCAGTGGTTGA-3'；下游5'-GCGCCCGGGGTTATGCTGGTTGTA-3'；Smad2/3上游5'-TCCACCAGGCTGTAATCTCAAGA-3'；下游5'-GACATGCTTGAGCAACTGACT-3'；GAPDH上游5'-CTACCCACGGCAAGTTCAAT-3'，下游5'-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3'。反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，循环35次；72℃延伸10 min。每组重复3次。各基因的相对表达量按公式(2-△△Ct法)计算。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠肺功能比较

与假手术组相比，COPD组大鼠VE、PEF、FEV0.3均显著降低(P<0.05)；与COPD组相比，syndecan-1过表达组大鼠VE、PEF、FEV0.3均显著升高(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Results of pulmonary function test in each

2.2 各组大鼠气道肺组织病理学检查

光镜下观察结果发现，假手术组大鼠气道壁完整，气道腔无狭窄，肺组织无明显炎性细胞浸润，无肺气肿形成；COPD组大鼠气道黏膜脱落，管腔狭窄，气道壁较多炎性细胞浸润，肺气肿严重；syndecan-1过表达组大鼠气道黏膜脱落及气道壁炎性细胞浸润数减少，管腔狭窄、肺气肿情况均有所改善(图1)。

Fig. 1 Histopathological findings of airway and lung in each group (HE staining ×100)

2.3 各组大鼠肺组织中syndecan-1的表达

免疫组化结果显示，syndecan-1的表达位于细胞质和细胞膜，以细胞质、细胞膜染为淡黄及棕黄色为阳性表达。与假手术组相比，COPD组大鼠肺组织syndecan-1阳性表达减少而syndecan-1过表达组大鼠肺组织syndecan-1阳性表达增加(图2)。

Fig. 2 Expression level of syndecan-1 in lung tissue of rats in each group (Immunohistochemistry SP method ×200)

2.4 各组大鼠肺组织中vimentin、E-cadherin的表达水平

免疫组化结果显示，vimentin阳性主要定位于细胞质，E-cadherin阳性主要定位于细胞膜。与假手术组相比，COPD组大鼠肺组织vimentin mRNA表达水平升高而E-cadherin mRNA表达水平降低(P<0.05)；与COPD组相比，syndecan-1过表达组大鼠肺组织vimentin mRNA表达水平降低而E-cadherin mRNA表达水平增加(P<0.05，图3，图4，表2)。

Fig. 3 Expression level of vimentin in lung tissue of rats in each group (SP immunohistochemical method ×200)

Fig. 4 Expression level of E-cadherin in lung tissue of rats in each group (Immunohistochemistry SP method ×200)

Tab. 2 Expressions of vimentin and E-cadher mRNA in lung tissue of rats in each n=10)

2.5 各组大鼠肺组织中TGF-β1和Smad2/3的表达水平

与假手术组相比，COPD组大鼠肺组织中TGF-β1、Smad2/3 mRNA表达水平，TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3的蛋白表达均显著升高(P<0.05)；与COPD组相比，syndecan-1过表达组大鼠肺组织TGF-β1、Smad2/3 mRNA表达水平，TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3的蛋白表达均显著降低(P<0.05，表3，表4，图5)。

Tab. 3 Expressions of TGF - β1 and Smad2/3 mRNA in lung tissue of rats in each n=10)

Tab. 4 Expressions of TGF - β1 and Smad2/3 protein in lung tissue of rats in each n=3)

Fig. 5 Expressions of TGF-β1 and Smad2/3 protein in lung tissue of rats in each group

3 讨论

COPD已成为全球常见疾病，其发病率一直在上升，吸烟是COPD发病的主要危险因素[6]。本研究通过烟熏联合气管注射脂多糖建立COPD大鼠模型，通过肺组织病理学变化及肺功能变化判断COPD模型是否建立成功。结果发现假手术组大鼠气道壁完整，气道腔无狭窄，肺组织无明显炎性细胞浸润，无肺气肿形成；COPD组大鼠气道黏膜脱落，管腔狭窄，气道壁较多炎性细胞浸润，肺气肿严重；与假手术组相比，COPD组VE、PEF、FEV0.3均显著降低。上述结果均提示本研究COPD大鼠模型建立成功。

EMT被认为是肿瘤生长、侵袭和转移的关键因子[7]。目前已有研究表明，COPD患者的支气管上皮细胞波形蛋白的表达增加，上皮钙粘蛋白的表达减少，表明EMT参与了COPD的发生发展[8]。上皮钙粘蛋白(E-cadherin)属于钙依赖性跨膜粘附蛋白家族成员，在调节器官、组织形态发育和维持组织结构完整性方面具有重要作用，起到预防和减少肿瘤细胞粘附的作用[9]。有研究发现，在肿瘤的发展过程中E-cadherin表达降低可导致肿瘤细胞间粘附力下降，促进EMT的发生[10]。波形蛋白(vimentin)是一种细胞骨架蛋白，也是一种重要的间质标志物，是诱导EMT的关键因子[11]。有研究发现，vimentin在多种上皮性肿瘤中也有异常表达，与癌细胞的分化、侵袭和转移密切相关[12]。本研究免疫组化结果显示，vimentin阳性主要定位于细胞质，与假手术组相比，COPD组大鼠肺组织vimentin mRNA表达水平显著升高；E-cadherin阳性主要定位于细胞膜，与假手术组相比，COPD组大鼠肺组织E-cadherin mRNA表达水平显著降低；上述实验结果提示COPD模型大鼠肺脏发生EMT。

有研究表明，EMT形成与多种信号通路有关，主要包括TGF-β/Smad及WNT/β-catein信号通路[13]。转化生长因子β1(TGF-β1)是一种分泌到肿瘤微环境中的多功能细胞因子，可依赖Smads信号分子诱导细胞EMT的发生，导致纤维化[14]。孔晓武等人[15]研究发现，抑制TGF-β信号通路可下调vimentin蛋白表达水平，上调E-cadherin蛋白表达水平，减轻EMT诱导膀胱癌转移。代炜等人[16]研究发现，TGF-β1可通过转移相关蛋白1(MTA1)下调E-cadherin表达并促进舌癌的侵袭和转移。本研究结果发现，COPD组大鼠肺组织中TGF-β1、Smad2/3 mRNA水平较假手术组均显著升高，且肺组织中TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3蛋白表达水平均显著升高，提示COPD模型大鼠TGF-β/Smad信号通路激活，促进vimentin的表达，抑制E-cadherin的表达，参与EMT的发生。

Syndecan-1是维持正常上皮形态结构的完整性和稳定性的重要因素之一，参与细胞粘附、上皮形态发生和血管生成[17]。有研究表明，肿瘤细胞表面syndecan-1表达减少和缺少可导致细胞的粘附能力下降，进而诱发肿瘤的浸润、生长、转移[18]。本研究结果发现，syndecan-1的表达位于细胞质和细胞膜，以细胞质、细胞膜染为淡黄及棕黄色为阳性表达。与假手术组相比，COPD组大鼠肺组织syndecan-1阳性表达显著减少；syndecan-1过表达组大鼠肺组织syndecan-1阳性表达显著增加。HE染色结果显示，syndecan-1过表达组大鼠气道黏膜脱落及气道壁炎性细胞浸润数减少，管腔狭窄、肺气肿情况均有所改善；与COPD组相比，syndecan-1过表达组VE、PEF、FEV0.3均显著升高，提示过表达syndecan-1可保护COPD大鼠的肺脏损伤。与COPD组相比，syndecan-1过表达组大鼠肺组织vimentin mRNA表达水平降低而E-cadherin mRNA表达水平升高；此外，syndecan-1过表达组大鼠肺组织TGF-β1、Smad2/3 mRNA显著降低、TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3的蛋白表达水平均显著降低，提示过表达syndecan-1可抑制TGF-β/Smad信号通路，减轻EMT，改善COPD大鼠肺组织损伤。

综上所述，COPD大鼠体内TGF-β/Smad信号通路活化且存在肺EMT；过表达syndecan-1可抑制TGF-β/Smad信号通路，减轻EMT，改善COPD大鼠肺组织损伤，为治疗COPD提供新思路。