鸡爪槭(Acer palmatum Thunb.)品种‘赤枫’组培再生体系的建立

马建华, 朱晓菲, 何程相, 丁龙梅, 向明剑,黄良伟, 姜良珍, 谢松林*

(1.四川七彩林科股份有限公司研究院, 四川省名特优新彩色苗木繁育工程实验室, 四川 巴中 635600;2.成都大学药学与生物工程学院, 成都 610106)

鸡爪槭‘赤枫’(Acerpalmatumc.v.‘Sango kaku’)是槭树科鸡爪槭组的一个园艺品种，又名‘珊瑚阁’，1882年培育而成[1]。‘赤枫’为落叶小乔木，新枝红色；单叶对生，掌状5～7裂，裂片披针形，先端锐尖，边缘具细锯齿；其嫩叶橙黄色，裂片周围具有镶边状红色边晕。‘赤枫’一年四季均有较高观赏价值，其春叶绿色，夏叶渐渐变为黄绿色，秋天叶子变为黄色或赤茶色，冬天落叶后枝条红色[2]，是近年来广受欢迎的园林绿化新兴树种。

在‘赤枫’苗木生产过程中，一般采用嫁接繁殖。田晓明等[3]对‘赤枫’嫁接技术进行深入研究，建立了适宜于‘赤枫’的嫁接方式，成活率达70%以上。嫁接繁殖能迅速形成工程苗，但因其繁殖材料及嫁接季节受外界环境影响较大，繁殖系数低，不利于规模化种苗生产。组培繁殖技术不受外界环境因素影响、繁殖系数高，能迅速扩繁产生大量种苗。然而，国内外对‘赤枫’组培繁育技术研究鲜有报道。国外在鸡爪槭体细胞胚胎发生[4]、形态分布[5]、栽培措施[6]等方面进行了研究，关于组培繁殖仅见尖尾槭[7]及鸡爪槭砧木[8]等同科植物组培技术报道。国内相关技术研究中，仅有李倩中等[9]对鸡爪槭‘金陵黄枫’的组培繁殖技术进行了细致研究，此外，研究人员对复叶槭、红翅槭、金叶复叶槭、自由人槭等同科植物的组培繁殖技术进行了相关研究[10-13]。

本研究以‘赤枫’茎段为外植体，通过组织培养各环节因素筛选，以期建立‘赤枫’组培快繁技术体系，填补‘赤枫’组培繁殖技术研究空白，为工厂化育苗及后期规模化嫁接繁殖及进一步研究提供材料基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

‘赤枫’健康无病害枝条采集于四川七彩林科股份有限公司品种资源圃。益培隆组织培养高效抗污杀菌剂，其他试剂为国产分析纯，均购自于北京康倍斯科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1外植体处理及培养条件 于2013年2—11月，分别采集‘赤枫’茎段外植体。用75%酒精灭菌30 s，再用0.1%升汞灭菌10 min，无菌水清洗5遍后，接种于MS+0.2 mg· L-1IAA培养基上。培养间环境光/暗为16 h /8 h，光照3 000 lx，温度(25±1) ℃，湿度50%±10%的条件下进行培养。30 d后统计污染率及萌发率,筛选最佳外植体采集月份。

通过上述试验获得最佳采集月份后，在75%乙醇处理30 s,再用0.1%升汞灭菌10 min的基础灭菌方式下，进一步进行不同方式的灭菌处理。分别采用50%多菌灵400倍液浸泡1 h的预处理、培养基中加入益培隆、益培隆灭菌前后浸泡1 h三种处理方式。

1.2.2启动培养 将经过灭菌处理的外植体分别接种到含有不同6-BA、NAA、KT、IAA配比的MS培养基中。接种30 d后，观察腋芽生长状况，统计芽诱导率，筛选最佳启动培养基。

芽诱导率=腋芽萌发外植体数/接种外植体数×100%

1.2.3增殖培养 将启动培养萌发出的2～3 cm长的腋芽剪下，转接于添加不同6-BA、NAA、TDZ、IAA配比的MS培养基中。40 d后统计增殖率及增殖系数，筛选最佳增殖培养基。

增殖率=产生丛生芽的腋芽数/转接总腋芽数×100%

增殖系数=产生丛生芽单芽数/转接总腋芽数×100%

1.2.4生根培养 选择丛生芽上约2～3 cm左右且生长健壮的单芽，转接入添加不同IBA、NAA、IAA配比的1/2MS培养基中。30 d后统计不定芽苗的生根状况。

生根率=生根单芽数/转接总单芽数×100%

1.2.5炼苗移栽 把经过不定根诱导培养后根系状态良好、生长健壮、长约5～7 cm的‘赤枫’组培苗转移到温室大棚中炼苗。炼苗环境保持干净，炼苗前适当喷洒多菌灵。通过不同的闭瓶炼苗和开瓶炼苗时间后炼苗移栽。炼苗时洗净组培苗上的培养基，移栽进珍珠岩、蛭石、草炭土、泥沙等不同配比的基质中。炼苗环境温度(25±4) ℃，湿度80%±20%，用遮阳网遮盖，避免正午阳光直射。30 d后统计炼苗成活率，筛选最佳炼苗时间及炼苗基质。

炼苗成活率=成活植株数/移栽总植株数×100%

1.2.6数据分析

数据整理采用Excell软件，数据分析采用SPSS 19.0统计学软件。

2 结果与分析

2.1 启动培养

2.1.1外植体采集季节选择 不同月份(外植体灭菌条件和培养条件均相同)采集的外植体在启动培养时污染结果统计如表1所示，可以看出，在全年采集外植体试验中，各月份之间的污染率差异显著，3月和11月的外植体污染率较高，6月污染率最低。从外植体腋芽萌发率看，10月份最高，但污染率也高。6月萌发率较低，但与的7、8、9、11月的差异不显著，且污染率最低。因此，选择6月为外植体采集的最佳时期。

表1 外植体采集时间对‘赤枫’外植体污染和萌发的影响Table 1 Effects of sampling time on pollution and germination of ‘Sango kaku’ explants

2.1.2外植体灭菌处理 将6月采集的外植体用不同方式进行灭菌处理，结果如表2所示，‘赤枫’枝条经50%多菌灵400倍液浸泡1 h后再进行常规的乙醇+升汞的灭菌处理能显著降低‘赤枫’外植体的污染率，且能保持较高的腋芽萌发率。因此，‘赤枫’外植体灭菌的最佳处理方式为：50%多菌灵400倍液浸泡1 h后， 75%乙醇灭菌30 s，最后0.1%升汞灭菌处理10 min。

表2 不同灭菌处理方式对‘赤枫’外植体污染和萌发的影响Table 2 Effects of different sterilization treatments on the pollution and germination of ‘Sango kaku’ explants

2.1.3启动培养基的选择 将灭菌后的带芽茎段接种于不同的培养基中进行外植体启动培养。挑出长菌污染茎段后，统计其萌发率，结果(表3)表明，MS基本培养基添加单种激素对‘赤枫’枝条萌发率的影响显著优于添加多种激素。单种激素添加的萌发率在66.6%～92.1%之间；两种激素混合添加的萌发率在40.2%～64.8%之间；三种激素混合添加的萌发率在51.9%；四种激素混合添加的萌发率在54.0%。单种激素的对比中， IAA的效果显著优于其他激素，萌发率达到90%以上。因此，‘赤枫’外植体萌发的最佳培养基为：MS+0.5 mg·L-1IAA。

表3 不同激素对‘赤枫’外植体启动培养的影响Table 3 Effects of different hormones on the initiation culture of ‘Sango kaku’ explants

2.2 增殖培养

腋芽在各增殖培养基中生长40 d后，观察产生丛生芽的节段数量，统计分化率和增殖系数。由表4可知，不同激素组合的MS培养基上‘赤枫’的增殖率和增殖系数差异明显。6-BA和IAA组合的分化率在87.0%～96.0%之间，增殖系数在3.0～6.0之间；TDZ和IAA的组合分化率在59.7%～90.9%之间，增殖系数在2.1～3.9之间；6-BA和NAA组合的增殖率为50.9%，增殖系数为3.8；TDZ和NAA组合的增殖率为71.5%，增殖系数为2.2。其中，‘赤枫’在添加了2.0 mg·L-1的6-BA和0.5 mg·L-1IAA培养基上不定芽分化率达到96%，增殖系数为6.0，均显著高于其他培养基，且在此培养基上生长的丛生芽状态较好，更加有利于下一步继代培养。因此，‘赤枫’增殖的最佳培养基为：MS+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IAA。

表4 不同激素对‘赤枫’腋芽增殖的影响Table 4 Effects of different hormones on the proliferation of ‘Sango kaku’ axillary buds

2.3 生根培养

对‘赤枫’不定芽在不同培养基中的生根情况进行调查统计，结果(表5)表明，不同激素的培养基上‘赤枫’不定芽苗的生根状况显著不同。添加IBA培养基上，赤枫不定芽苗的生根率在55.1%～75.6%之间，平均生根条数在1.2～2.9之间，新生根较为细长；添加NAA的培养基上生根率在75.9%～95.4%之间，平均生根条数在2.2～3.5之间，新生根较为粗壮；不同激素配比的培养基上生根率则在60%上下，平均生根条数在1.9～2.7之间，新生根较为粗壮且带有愈伤。综合生根率以及根系生长状况，‘赤枫’最佳生根培养基为：1/2 MS+0.3 mg·L-1NAA。

表5 不同激素对‘赤枫’不定芽苗生根的影响Table 5 Effects of different hormones on rooting of adventitious sprouts of ‘Sango kaku’

2.4 炼苗移栽

2.4.1炼苗时间 不同炼苗时间处理下，‘赤枫’组培苗的成活情况如表6所示：随着闭瓶炼苗和开瓶炼苗天数的增加，成活率显著上升，炼苗后的驯化苗健壮程度也呈上升趋势。其中闭瓶炼苗6 d，开瓶炼苗3 d能使成活率达到93%，植株健壮；闭瓶6～10 d，开瓶3～5 d成活率稳定，植物状态稳定；再增加炼苗天数，成活率降低。因此，‘赤枫’最佳炼苗时间为：闭瓶炼苗6 d，开瓶炼苗3 d。

表6 不同炼苗时间对炼苗成活率的影响Table 6 Effects of different refining time on survival rate of refining seedlings

2.4.2炼苗基质 将炼苗后的‘赤枫’，移栽进不同的基质中，成活情况见表7。可以看出，不同移栽基质对鸡爪槭‘赤枫’组培苗的移栽成活率有显著影响，基质混合使用的效果显著优于单独使用。其中，单种基质的移栽成活率在73.3%～82.0%之间，驯化苗植株偏黄；两种基质混合添加的移栽成活率在80.0%～86.7%之间，驯化苗植物生长健壮，其中,草炭∶蛭石∶珍珠岩=1∶1∶1混合基质的栽培效果相对较好，平均成活率达90.5%，驯化苗植株青绿。因此，‘赤枫’炼苗的最佳基质是草炭∶蛭石∶珍珠岩=1∶1∶1的混合基质。

表7 不同基质对‘赤枫’组培炼苗成活率的影响Table 7 Effects of different substrates on the survival rate of ‘Sango kaku’ seedlings

2.5 组培苗生长情况

本研究通过诱导茎段腋芽萌发，转接萌发的腋芽诱导丛生芽实现增殖，切割丛生芽单芽进行生根培养，建立了鸡爪槭‘赤枫’组培繁育技术体系，组培苗生长状态良好，根系发达、健壮(图1)。

A:启动腋芽萌发；B: 增殖产生丛生芽；C: 生根苗；D: 生根根系A: Axillary bud germination; B: Proliferation to produce cluster buds; C: Rooting seedlings; D: Roots图1 ‘赤枫’组培过程中形态Fig.1 Phenotype of tissue culture during process

3 讨论

本试验通过研究建立了赤枫组培繁殖再生技术体系，以6月采集的‘赤枫’带芽茎段为外植体，经50%多菌灵400倍液浸泡1 h 后，以75%乙醇30 s+0.1%升汞10 min的灭菌，接种到MS+0.5 mg·L-1IAA的培养基上诱导腋芽萌发，切割萌发的单芽，转接于MS+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IAA的培养基中诱导丛生芽增殖，切割不定芽苗转接于1/2MS+0.3 mg·L-1NAA的培养基中诱导生根。组培生根苗闭瓶炼苗6 d，开瓶炼苗3 d后，移栽到草炭：蛭石：珍珠岩=1:1:1的基质中进行驯化移栽，成活率可达90%。另外，培养基中添加0.3 g·L-1的活性炭可抑制培养材料的褐化。

外植体污染是组培过程的常见问题[14]。本研究使用常规灭菌剂乙醇和升汞能在一定程度上控制污染率，这与前人研究结果一致[14-15]。除此之外，本试验对最佳外植体的采集月份进行了试验，结果证明，外植体最佳采集时间是全年中的6月，这与红翅槭[11]和自由人槭[13]的外植体采集时间一致。2月、3月外植体污染率较高，这可能是因为接种的外植体为冬枝，自身带菌严重；而7月以后污染率升高的原因可能是进入雨季，湿度加大导致外植体带菌较多。

植物生长调节物质对植物组培成功有决定性影响。植物种类、器官不同，适宜的植物生长调节剂种类及搭配比例不同[16-18]。本试验采用激素6-BA和IAA的组合实现了对鸡爪槭‘赤枫’腋芽的增殖，这与复叶槭[10]、红翅槭[11]、尖尾槭[7]的研究结果一致，但在使用浓度上存在差异。本研究使用激素NAA实现了鸡爪槭‘赤枫’的生根培养，与鸡爪槭‘金陵黄枫’[9]和复叶槭[10]的生根培养研究结果一致，但在使用浓度上存在差异。本试验在启动培养中，单种激素的添加优于多种激素的添加，这可能是外植体枝条本身储存了部分营养及激素，外植体的萌发多半依赖于自身的激素条件，多种激素的添加反而抑制其生长或者使枝条过多分化愈伤组织，从而降低了萌发率。

前人对槭树科的同科植物组培技术研究中，使用了器官发生[12]、愈伤组织诱导[11]、体细胞胚诱导[7]等途径实现离体再生。本试验采用腋芽诱导丛生芽的发生途径，与李倩中等[9]对鸡爪槭‘金陵黄枫’的诱导方式相似。李艳敏等[12]通过器官发生途径实现了金叶复叶槭的增殖，增殖系数为3.11，本试验通过诱导丛生芽，增殖系数最高为6.0。

褐化是植物组织培养中的三大难题之一，而木本植物本身富含单宁、木质 素、色素等物质，褐化较之草本植物严重[19-20]。招雪晴等[13]在对自由人槭的防褐化中采用了外植体取材部位的试验处理。在组织培养的各个时期，‘赤枫’均有不同程度的褐化出现。为克服褐化现象，本研究还在试验过程中对比了不同抗褐化剂对‘赤枫’组培过程中褐化现象的抑制作用。试验结果显示，不同抗褐化剂都能在一定程度上抑制褐化，VC、亚硫酸钠、硫代硫酸钠的抑制效果较为相似，抑制效果较轻；柠檬酸和PVP的抑制效果较为相似，稍优于VC、亚硫酸钠、硫代硫酸钠的抑制效果；其中添加0.3 g·L-1的活性炭效果最为明显。

李艳敏等[12]对金叶复叶槭的炼苗时间研究结果是闭瓶炼苗4～5 d，开瓶炼苗1～2 d。本试验炼苗时间略高于此，闭瓶炼苗6 d，开瓶炼苗3 d后具有最高的炼苗成活率。在炼苗基质方面，金叶复叶槭[12]使用蛭石的炼苗成活率在90%左右，红翅槭[11]使用蛭石：珍珠岩=1:1的基质，炼苗成活率在95%以上，本试验采用草炭∶蛭石∶珍珠岩=1∶1∶1混合基质的栽培效果相对较好，其平均成活率达90%。这可能与‘赤枫’的生长特性有关，其嗜中性偏酸的排水性良好的肥沃土壤，而蛭石偏碱，故对‘赤枫’的生长有一定的影响。

本研究建立‘赤枫’组培繁育技术体系，进一步丰富了国内对鸡爪槭组培的研究成果。为进一步工厂化育苗提供了技术支撑，同时，研究成果将为‘赤枫’进一步分子育种及遗传改良研究奠定基础。