烯丙孕素内服溶液的临床药效和靶动物安全性研究

杨海峰, 李艳艳, 陈晓兰, 姚诗贇, 黄亚奇,夏良友, 李宇琛, 卜仕金*

(1.江苏农牧科技职业学院, 江苏 泰州 225300; 2.扬州大学兽医学院, 江苏 扬州 225009)

随着社会经济发展和科技进步，养猪业趋向规模化、集约化、标准化、机械化和自动化方向发展，这就要求对繁殖猪群实行整批管理，使整批母猪同步发情、排卵、配种及产仔，因此,发情控制技术的研究与应用显得十分重要。同期发情是利用激素制剂调整母猪的发情周期，使其在预定时间内集中发情的一种技术，该技术对规模化猪场批次化生产管理具有重要意义[1-2]。同期发情的母猪分娩时间相对集中，便于集中断奶、全进全出、同步进入下一个繁殖周期，从而有效提高生猪生产效率，降低疫病感染风险，给养猪业带来较高经济效益。

烯丙孕素(altrenogest)是一种人工合成的口服型促孕激素[3]，通过抑制促性腺激素分泌而调整母畜发情周期[4]，最早于1984年在法国获得上市许可，在欧盟和美国被批准用于犬(母犬黄体不足[5])、马(母马同期发情[6]、孕酮水平不足的母马妊娠维持[7]、长期使用抑制赛马发情以保持其竞技状态[8-9])和猪(母猪同期发情[10-11])。烯丙孕素作用于下丘脑和垂体的孕酮受体，通过负反馈调节机制，抑制促性腺激素卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone, LH)的分泌，使卵泡发育受阻，动物在给药期间自然发情停止；连续给药一定时期后停止药物处理，FSH和LH恢复正常水平，卵泡迅速生长和成熟，之后，动物同步开始发情周期[12-13]。目前，欧美发达国家已将烯丙孕素作为养猪生产中必不可少的同期发情调控剂，且无更好的替代产品[14]。

我国于“十三五”期间启动了烯丙孕素原料及其制剂研发，国内多家兽药企业联合农业院校参与实施，宁波三生生物科技有限公司、宁波第二激素厂、天津市中升挑战生物科技有限公司先后于2018年2月、4月和12月获批烯丙孕素内服溶液国家二类新兽药证书。烯丙孕素内服溶液给单剂量内服后，在母猪体内具有吸收迅速、消除较慢、有效血药浓度维持较长的药物代谢动力学特征[15]；母猪连续内服给药18 d，停药后猪组织中药物残留规律为肝>肾>脂肪>肌肉，建议休药期为9 d[16]。安全、有效、质量可控是药品的三大核心要素，本研究根据我国兽药评审中心《兽药临床试验技术指导原则》[17]，评价了烯丙孕素内服溶液的临床药效和靶动物安全性，为其新兽药注册申报和临床合理应用提供了依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1药品 受试药物：国产烯丙孕素内服溶液，含量4 mg·mL-1，规格450 mL·瓶-1，批号1506003，天津市中升挑战生物科技有限公司产品。对照药物：进口烯丙孕素内服溶液，商品名Altresyn，含量4 mg·mL-1，规格1 080 mL·瓶-1，批号150A1，法国诗华动物保健有限公司产品。

1.1.2仪器与耗材 AU5800型全自动血液生化分析仪，美国贝克曼库尔特公司；XN-20型全自动模块式血液体液分析仪，日本希森美康株式会社；RM2235型石蜡切片机，德国徕卡公司；Axio Scope A1型正置显微镜，配备AxioVision Rel. 4.8显微图像分析系统，德国卡尔蔡司显微成像有限公司；2 mL抗凝真空采血管、5 mL促凝真空采血管，成都瑞琦科技实业有限责任公司；血液生理生化检测试剂均为原厂配套试剂。

1.1.3试验动物 临床药效试验选用性成熟且至少经历过一次发情周期的长大二元后备母猪，由江苏盐城市大丰区中北畜牧场、上海崇明县益民畜禽养殖场和新海农场爱茵康畜禽养殖场提供；靶动物安全性试验选用性成熟的苏姜后备母猪，由江苏泰兴市苏姜种猪有限公司提供。

1.2 烯丙孕素内服溶液调控母猪同期发情的临床药效试验

1.2.1试验动物选择与淘汰 在具有一定养殖规模的种猪场中选择供繁殖用的后备母猪作为试验对象，必需满足以下条件：①8月龄左右的性成熟后备母猪，且给药前至少经历过一次发情周期；②临床健康，生长发育良好，体重110 kg以上，未发现可对健康造成影响的疾病；③外生殖器无明显异物，也未见有病理性的红肿或液体流出[18]。试验过程中，入选动物如发生以下几种情况需要淘汰：①患有对身体有一定影响的疾病；②计划在人工授精当周发病的动物；③饲养记录不全的动物。

1.2.2试验动物饲养管理 受试母猪在定位栏内饲养，每个定位栏饲养一头。在试验期间所有入选的受试动物将依据所在种猪场现有条件和饲养规程进行饲养管理，每天定时饲喂2次，自由饮水。

1.2.3动物来源、分组与给药 临床药效试验分为实验性临床试验(Ⅱ期临床试验)和扩大临床试验(Ⅲ期临床试验)两个阶段，均为非盲法评价。实验性临床试验在江苏盐城市大丰区中北畜牧场种猪场进行，将满足入选标准的受试动物随机分为4组，分别为烯丙孕素内服溶液高剂量组(25 mg·d-1)、中剂量组(20 mg·d-1)、低剂量组(10 mg·d-1)和空白对照组(自来水5 mL)。扩大临床试验在江苏盐城市大丰区中北畜牧场、上海崇明县益民畜禽养殖场和新海农场爱茵康畜禽养殖场进行，将满足入选标准的受试动物随机分为受试药物组、推荐剂量组(国产烯丙孕素内服溶液)和药物对照组组(进口烯丙孕素内服溶液)，给药剂量均为20 mg·d-1。给药前预先将达到性成熟的后备母猪移入定位栏内饲养，给药时将烯丙孕素内服溶液(或自来水)洒在饲料表层，让动物经口摄入，每头动物每天上午定时给药一次，连续给药18 d。

1.2.4发情鉴定和人工授精 各受试动物在停药后第2 d起，每天观察母猪发情迹象，上午和下午用公猪进行诱情，根据母猪阴门检查和“静立反应”进行发情鉴定，发情母猪8～12 h内进行第一次输精，间隔8～12 h后进行第二次输精[19-20]。人工授精后每天观察母猪的生理变化情况确定是否怀孕。

1.2.5临床药效评价 烯丙孕素内服溶液调控母猪同期发情临床药效的主要评价指标为受试母猪从停药后到出现发情反应的间隔时间、发情率、发情集中度、妊娠率等[21]。

1.3 烯丙孕素内服溶液的靶动物安全性试验

1.3.1试验动物选择与饲养管理 靶动物安全性试验的动物选择与饲养管理参照临床药效试验执行。

1.3.2动物来源、试验分组、给药 靶动物安全性试验在江苏泰兴市苏姜种猪有限公司进行，24头达到性成熟的苏姜后备母猪随机分为4组，每组6头，分别为国产烯丙孕素内服溶液1倍推荐剂量组(20 mg·d-1)、3倍推荐剂量组(60 mg·d-1)和5倍推荐剂量组(100 mg·d-1)和空白对照组(自来水5 mL)。给药方法同临床药效试验，连续给药18 d。

1.3.3临床观察 每天观察并记录试验动物精神状况、采食量、呼吸、活动、排泄、可视黏膜等临床症状，给药前、第9和18 d(给药结束当天)各组动物分别称重和测量体温。

1.3.4血常规指标与血清生化指标测定 在给药前、给药第9和第18 d(每次给药结束后4 h内)分别经母猪的前腔静脉采集血液。取2 mL血液置于抗凝真空采血管中，采用全自动模块式血液体液分析仪测定红细胞计数(red blood cell，RBC)、白细胞计数(white blood cell，WBC)、血红蛋白(hemoglobin，HGB)、红细胞压积(hematocrit，HCT)、平均血红蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin， MCH)、平均血红蛋白浓度(mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC)、血小板(platelet，PLT)、中性粒细胞计数(neutrophils，NEUT)、淋巴细胞计数(lymphocyte，LYMPH)、单核细胞计数(monocyte，MONO)、嗜酸性粒细胞计数(eosinophils，EO)、嗜碱性粒细胞计数(basophils，BASO)等血常规指标。取4 mL血液置于促凝真空采血管中，采用全自动血液生化分析仪测定直接胆红素( direct bilirubin，DBIL)、总蛋白(total bilirubin，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、球蛋白(globulin，GLO)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶酶(aspartate aminotransferase，AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、尿素(urea，UREA)、肌酐(creatinine，CRE)、葡萄糖(glucose，GLU)、钾(K+)、钠(Na+)、氯(Cl-)、钙(Ca2+)等血清生化指标。血液生理生化指标检测在泰州市第四人民医院检验科完成。

1.3.5尸体剖检与组织病理学检查 试验结束后(第19 d)扑杀各组所有动物，进行尸体剖检，观察大体病变；采集胃、小肠、卵巢、肝脏、心脏、脾脏、肾脏等脏器组织，经10%福尔马林溶液固定24 h后，石蜡切片，HE染色，正置显微镜进行组织病理学检查，在扬州大学兽医学院病理组完成。

1.4 数据处理

应用Micrsoft Excell对数据进行处理，应用SPSS19.0软件对结果进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 烯丙孕素内服溶液诱导后备母猪同期发情的临床药效

2.1.1实验性临床试验结果分析 实验性临床试验结果见表1。国产烯丙孕素内服溶液高、中、低剂量组的母猪从停药到出现发情反应的间隔时间分别为(3.45±0.81)(3.35±0.66)(5.21±2.65)d，发情率分别为100%(20/20)、100%(20/20)和95%(19/20)。空白对照组的母猪因自然发情不受调控，发情时间变化较大，因此仅收集考察了10头母猪的发情及配种受孕情况，其中3头母猪在给药期间发情(未纳入结果统计)，停药后有7头母猪发情，这7头母猪平均发情间隔时间为(11.71±5.39)d。比较烯丙孕素内服溶液各剂量组的发情集中度，低剂量组的母猪有16头在停药后一周内发情，3头在停药8 d后发情，1头母猪一直未发情；中、高剂量组母猪均集中在停药一周内发情。因此，将中剂量(20 mg·d-1)作为国产烯丙孕素内服溶液调控母猪同期发情的推荐剂量进行扩大临床试验。

表1 实验性临床试验结果Table 1 Results of experimental clinical trials

2.1.2扩大临床试验结果分析 扩大临床试验结果见表2。受试药物组和药物对照组的母猪在烯丙孕素调控下均表现出良好的同期发情效果，发情间隔时间分别为(3.59±1.07)(3.75±1.22)d，发情率分别为96.72%(59/61)和98.33%(59/60)，且绝大多数受试母猪集中在停药一周内发情，发情配种后均全部受孕，未有妊娠终止或流产现象。两组受试母猪的发情间隔、发情率、发情集中度、妊娠率、窝产活仔数等临床药效评价指标均无显著差异(P>0.05)。试验结果表明，国产烯丙孕素内服溶液按推荐剂量(20 mg·d-1)连续给药18 d，用于调控后备母猪同期发情，与法国诗华公司的进口产品具有同等的临床药效。

表2 扩大临床试验结果Table 2 Results of expanded clinical trials

2.2 烯丙孕素内服溶液的靶动物安全性

2.2.1临床表现 整个试验期间各组受试动物均无死亡，未见呕吐反应，精神状态、体温、采食、饮水、排泄和活动等均表现正常。试验结束时，各给药组动物的体重增长与空白对照组相比无显著差异(P>0.05)。

2.2.2血常规指标与血清生化指标分析 给药前、试验期间及试验结束时的血常规和血清生化指标测定结果分别见表3和表4。与空白对照组相比，给药至第9 d结束时，1倍剂量组的淋巴细胞数计数(LYMF)、5倍剂量组的血红蛋白(HGB)及3倍剂量组的白蛋白(ALB)差异显著(P<0.05)，至最后一次给药结束后，5倍剂量组的红细胞计数(RBC)、红细胞压积(HCT)和1倍及3倍剂量组的白蛋白(ALB)与空白对照组差异亦显著(P<0.05)，以上少数血液生理生化指标的变化与给药剂量没有明显的相关性，且均在母猪正常范围值内波动。结果表明，国产烯丙孕素内服溶液在5倍推荐剂量下对猪的血常规指标和血清生化指标无明显的异常影响。

表3 烯丙孕素内服溶液对母猪血常规指标的影响Table 3 Effects of altrenogest oral solution on blood routine index in mature sows

表4 烯丙孕素内服溶液对母猪血清生化指标的影响Table 4 Effects of altrenogest oral solution on serum biochemical index in mature sows

2.2.3组织病理学变化 试验结束后将各组受试动物宰杀剖检，逐一进行大体病理学检查，均未发现任何肉眼可见的异常或可疑病变。进一步对5倍剂量组和空白对照组的猪只进行组织病理学检查，胃、小肠、卵巢、肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏等主要器官的组织切片如图1所示，未发现明显组织病理学变化。

图1 组织病理学变化(200×)Fig.1 Histopathological changes (200×)

3 讨论

烯丙孕素通过抑制促性腺激素FSH和LH的释放来抑制母猪发情，停药后激素重新释放，母猪重返发情并同期发情，以便于规模猪场实施批次化生产管理。与其他促进母猪同期发情的注射药物相比，烯丙孕素内服给药对母猪的刺激性小，因而在国外已广泛用于母猪同期发情。国产烯丙孕素内服溶液的给药途径、给药剂量、给药周期是参照欧洲进口产品的给药方案以及临床药效预实验制定。欧洲药品管理局(European Medicines Agency，EMA)和美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准烯丙孕素的给药途径为口服，母猪经口喂服操作不便，本研究采用将药液洒在饲料表面的方式给药，受试母猪在各自的定位栏中饲养，饲料槽是分开的，且每次给药后饲料很快被吃光，这样确保了烯丙孕素全部被内服，进而被母猪吸收利用。持续给药时间为18 d，主要与母猪的发情周期为18～23 d有关。

多名研究人员先后报道，烯丙孕素以20 mg·d-1的剂量给后备母猪饲喂，连用15～18 d，停药数日内母猪可集中发情，发情率85%～100%，并且对母猪卵泡发育、排卵时间和繁殖性能无不良作用[22-26]。Stevenson等[27]对烯丙孕素最佳给药持续时间进行了研究，观察14和18 d的持续给药对同期发情效果的影响，结果表明，持续给药18 d后备母猪表现出更为精确的同情发情，停药6 d内的发情率也更高(给药14 d为89%，给药18 d为96%)。本研究通过试验性及扩大临床试验评价了国产烯丙孕素调控后备母猪同期发情的临床效果，结果与国外相关报道相一致。在实验性临床试验中，国产烯丙孕素内服溶液高、中、低剂量组的母猪与空白对照组母猪自然发情相比，发情间隔时间显著缩短(P<0.05)，且中、高剂量组母猪的发情时间较低剂量组则更为集中，均在停药一周内发情，从而将中剂量(20 mg·d-1)作为临床推荐剂量。扩大临床试验中，国产烯丙孕素内服溶液组和进口药物对照组的母猪在药物调控下表现出良好的同期发情效果，停药后至出现发情反应的间隔时间、发情率、发情集中度、妊娠率、窝产仔数等均无显著差异(P>0.05)，说明国产烯丙孕素内服溶液调控母猪同期发情的临床效果与法国进口产品相当。

靶动物安全性试验是新兽药临床研究的重要内容，临床体征是从整体上反映药物对靶动物的影响；血细胞的数量及形态变化是判断该药物对血液系统有无毒性的重要依据；血液生化指标反映动物机体总体代谢、营养和健康状态，对确定药物临床潜在的毒性病理学靶器官具有重要的参考价值[28]。本研究通过比较给药前后的临床体征、血常规指标、血清生化指标及组织病理学变化，评价了烯丙孕素内服溶液对靶动物后备母猪的安全性。后备母猪分别按1倍、3倍、5倍推荐剂量给予国产烯丙孕素内服溶液，连续用药18 d，试验期间所有动物临床表现正常，血常规和血清生化指标均在正常参考范围之内，试验结束后所有动物剖检均未发现异常病变，5倍推荐剂量组动物的主要脏器组织镜检未发现明显病理改变；给药至第9 d和停药后24 h，受试药物各剂量组的少数血液生理生化指标与空白对照组相比差异显著(P<0.05)，但与给药剂量无明显相关性，且均在母猪正常范围值内波动。由此可见，国产烯丙孕素内服溶液在5倍推荐剂量(100 mg·d-1)范围内连续给药18 d，对母猪的血液生理生化功能和主要脏器未造成明显的不良影响。

综上所述，国产烯丙孕素内服溶液通过喷洒在饲料上内服给药，一次量，母猪20 mg，每日1次，连用18 d，可以调控母猪达到良好的同期发情效果，临床应用安全，可以现代生猪养殖中推广应用，对母猪批次化生产管理具有重要意义。