蜜蜂繁殖性状编码RNA和非编码RNA的研究进展

陈晓, 石巍

(中国农业科学院蜜蜂研究所, 北京 100093)

我国是养蜂大国，蜂产品产量居世界前列。同时，蜜蜂也是维持生态环境持续发展不可或缺的物种，是植物、特别是新兴设施作物的主要授粉昆虫。蜜蜂养殖业的关键是种蜂王，其优劣直接影响养蜂经济效益。繁殖性状是蜂王直接展现出的重要经济性状，同时也是蜂群产生经济效益的重要基础性状。因此，研究蜂王繁殖性状的遗传和调控机制是蜜蜂遗传育种领域的重要课题。

蜜蜂繁殖性状RNA的研究对于阐明蜜蜂繁殖性状的分子遗传机制意义重大，也为挖掘繁殖性状分子标记基因、开展分子育种工作，进而提高蜜蜂繁殖性能、增加养蜂经济效益奠定基础。伴随着分子生物学的发展，研究人员对蜂王繁殖性状分子遗传机制的研究从单个编码基因开始，到后来的高通量测序，从未停止过[1-5]。近几年，研究人员也加强了非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)在蜜蜂繁殖活动中作用的研究[6-10]。非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA，研究发现生物体越复杂，非编码RNA所占的比例就越大，说明非编码RNA在生命活动中发挥重要作用[7-8]。在蜜蜂繁殖过程中编码RNA(coding RNA，cRNA)和非编码RNA发挥了重要作用，近几年,研究人员通过高通量测序的方法获得了蜜蜂工蜂、处女蜂王和产卵蜂王卵巢和脑部组织的编码RNA和非编码RNA的表达情况，发现RNA的表达量与蜜蜂卵巢的激活状态紧密相关。本文详细阐述了蜜蜂繁殖性状相关的编码RNA和非编码RNA的研究进展，介绍了信使RNA(messenger RNA，mRNA)、小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)以及近几年才发现的环状RNA(circular RNA，circRNA)在蜜蜂卵巢激活、产卵等繁殖性状中取得的研究进展情况，以期为蜜蜂繁殖性状的分子遗传机制研究提供参考。

1 编码与非编码RNA

基因组DNA经过转录可以产生两大类RNA，一类是可以被翻译成蛋白质的编码RNA，即mRNA；另一类是不具有或具有较低编码能力的非编码RNA。许多物种的转录组测序结果显示，基因组中只有很小一部分基因编码蛋白，例如人类中仅有小于2%的基因组编码蛋白，因此,转录组中有很多非编码RNA序列。非编码RNA包括普遍存在的转运RNA(transfer RNA， tRNA)、核糖体RNA(ribosome RNA，rRNA)，以及具有组织表达特异性和时间表达特异性的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)、miRNA、circRNA、lncRNA等。

2 蜜蜂繁殖性状相关的编码RNA及非编码RNA

2.1 与蜜蜂繁殖性状相关的mRNA

关于mRNA在蜜蜂繁殖活动中的作用，多集中在保幼激素(juvenile hormones，JH)、蜕皮激素(ecdysteroids，Ec)和卵黄原蛋白(vitellogenin，Vg)上，或者是JH、Ec和Vg的下游基因[1]。JH和Ec是蜜蜂繁殖活动中最重要的激素[1-3]，而Vg是卵黄蛋白的前体，卵黄蛋白是蜜蜂卵的主要成分。

2008年以后，研究人员逐渐开始采用高通量方法研究蜜蜂繁殖相关过程中大规模基因的表达变化,结果表明，蜂王在卵巢激活过程中，其脑部和卵巢转录组水平发生了大规模的改变[4-6]。Kocher等[5]利用基因芯片的方法,比较了相同日龄的处女王、交尾一次但未开始产卵蜂王，以及交尾一次开始产卵蜂王的脑和卵巢的基因表达情况，发现有971个转录本在3组样本脑部差异表达，366个转录本在卵巢差异表达。还有研究人员利用基因芯片分析同龄处女王、不育工蜂和产卵工蜂脑部基因的表达，发现蜂王和不育工蜂约有2 000个基因差异表达，产卵工蜂和不育工蜂有221个基因差异表达，并且发现产卵工蜂基因的表达模式与蜂王更为类似[7]。mRNA表达发生了显著变化，说明其在蜜蜂繁殖活动中发挥重要作用。

根据前人的研究结果，对已知与蜜蜂繁殖性状相关的mRNA进行整理发现，一些基因与蜜蜂繁殖重要激素Ec及其受体、JH相互作用，从而影响蜜蜂的繁殖过程。例如，多巴胺受体2(dopamine receptor 2,Dopr2)、蜕皮激素受体(ecdysone receptor，Ecr)、蜕皮激素诱导蛋白75(ecdysone-induced protein 75,E75)、蜕皮激素调节基因(ecdysteroid-regulated gene E74，E74)、蜂王浆主蛋白3(major royal jelly protein 3,Mrjp3)等基因是Ec的下游基因，参与Ec引导的信号通路。E75、Kruppel 同系物1(Kruppel homolog 1,Kr-h1)和核激素受体Ftz-f1(nuclear hormone receptor Ftz-f1)是JH下游基因，参与JH介导的信号通路。E75连接了蜜蜂繁殖两大重要激素，Ec和JH的信号能相互协调共同作用于蜜蜂的繁殖过程。另外，还有一些基因虽没有直接参与Ec和JH信号通路，但依然在蜜蜂繁殖活动中发生了表达水平的显著变化，例如,细胞色素家族的多个基因，它们在蜜蜂繁殖活动的作用有待进一步挖掘。各mRNA在蜜蜂繁殖过程中潜在的功能作用见表1。

表1 蜜蜂繁殖性状相关的mRNATable 1 mRNAs related to honey bees reproductive traits

2.2 与蜜蜂繁殖性状相关的miRNA

miRNA是目前研究最广泛的非编码RNA，它是一类长度为19～25 nt的内源非编码RNA，广泛参与基因转录后调控活动。其中，多数miRNA具有高度保守性、表达时序性和组织特异性[13]。2018年3月，Sanger microRNA序列数据库(miRBase)中具有发夹前体序列蜜蜂miRNA 259条，成熟miRNA产物262条，关于蜜蜂miRNA的相关参考文献报道有1 482条。最新研究发现，蜜蜂卵巢组织的miRNA长度主要集中在20～23 nt，但是在蜂王和工蜂中又存在差别，蜂王卵巢组织的miRNA长度集中在20～22 nt，工蜂卵巢组织的miRNA长度集中在20～23 nt[13-17]。蜜蜂卵巢组织miRNA在每条染色体都有分布，在蜂王中，1号染色体miRNA分布最多；在工蜂中，15号染色体miRNA分布最多[13-17]。

最近的研究表明，miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等，具有重要的基因表达调控作用[13-14]。目前，研究人员已经在蜜蜂中发现一些与繁殖性状相关的重要miRNA，例如， Macedo等[10]和Ashby等[15]研究发现,ame-miR-bantam、ame-miR-184和ame-miR-315参与蜜蜂的组织结构重塑、细胞分化、卵巢发育和级型分化。此外，ame-miR-14和ame-miR-8与JH和Ec密切相关[8,15-16]，而JH和Ec是蜜蜂繁殖活动中最重要的激素[2-3]。以上研究说明，miRNA在蜜蜂繁殖活动中可能发挥着重要作用。与蜜蜂繁殖性状相关的miRNA见表2。

表2 蜜蜂繁殖性状相关的miRNATable 2 miRNAs related to honey bees reproductive traits

2.3 与蜜蜂繁殖性状相关的lncRNA

lncRNA是另一类重要的非编码RNA。它是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，其表达具有组织特异性和时序性，在细胞分化、发育、免疫等方面发挥重要作用[18-20]。蜜蜂卵巢组织的lncRNA长度范围从96 nt到20 674 nt不等，平均长度约为1 881 nt；lncRNA在每条染色体都有分布，其中在1号染色体分布最多，13号染色体分布最少；>93%的lncRNA包含2～5个外显子[21]。

2014年,Necsulea等[22]研究发现，lncRNA具有在动物中卵巢组织表达的偏好性；2015年,Jayakodi等[23]在蜜蜂的卵巢组织中发现了特异表达的基因间长链非编码RNA；2017年,Chen等[21]通过高通量测序和生物信息学方法鉴定和分析了蜜蜂卵巢组织特异表达的lncRNA。但是关于特定lncRNA在蜜蜂繁殖活动中的作用，还需要相关的分子实验进行验证。2011年,Graham等[24]鉴定了蜜蜂卵巢大小相关的QTL区间，这个QTL区间位于蜜蜂基因组11号染色体8.9～12.2 Mb，其对鉴定蜜蜂繁殖活动相关RNA具有重要参考价值。物理位置在蜜蜂卵巢大小相关的QTL区间内的，并且在蜜蜂卵巢组织特异表达的lncRNA见表3。

表3 分布在蜜蜂卵巢大小相关的QTL区间内且在蜜蜂卵巢组织特异表达的lncRNA[21]Table 3 lncRNAs located in the QTL region for ovary size in honey bees’ ovary[21]

2.4 与蜜蜂繁殖性状相关的circRNA

circRNA是一类新发现的重要调控因子，具有组织表达特异性、时序性等特点，能够吸附miRNA，对基因具有表达调控作用。circRNA与传统的线性RNA不同，是特殊非编码RNA分子，呈封闭环状结构，不受RNA外切酶的影响，表达更稳定，不易降解[25-28]。2012年,斯坦福大学和霍华德休斯医学研究所的科学家首次证实，人体细胞的基因表达时，circRNA分子比线性RNA分子是更普遍的现象[26]。circRNA已成为RNA领域的最新研究热点[27,29-31]。

蜜蜂卵巢组织circRNA的类型主要包括外显子circRNA、内含子circRNA、外显子-内含子circRNA、反义链circRNA、基因间circRNA。其中，外显子circRNA占80%以上，>57% circRNA包含2～3个外显子[32]。蜜蜂卵巢组织circRNA在每条染色体上都有分布，其中1号染色体分布最多，有超过2 000个circRNA，其他染色体各分布800～1 500个circRNA[32]。

circRNA的生物学功能主要是根据其来源基因的功能进行预测，如果circRNA来源于繁殖相关的基因，那么该circRNA在蜜蜂繁殖活动中就可能发挥关键作用。来源于蜜蜂繁殖性状相关的circRNA见表4。

表4 来源于蜜蜂繁殖性状相关基因的circRNA[32]Table 4 circRNAs produced by genes with known or suspected roles of in reproductive related processes in honey bees[32]

3 编码RNA与非编码RNA之间的相互作用

目前，对编码RNA与非编码RNA之间的相互作用研究较多的是miRNA与基因之间的相互作用。miRNA能够通过与靶基因相结合，影响基因的转录或转录后翻译，从而影响各种生物过程。在蜜蜂中，研究人员发现miR-14在卵巢激活和产卵启动时表达均显著下调[10]；而miR-14与Ecr的表达显著相关，并且Ecr的基因序列中含有miR-14的序列结合位点[11]，同时Ecr能够影响蜜蜂蜕皮激素含量和产卵[16-19]。因此，可以推断miR-14可能通过序列结合位点结合Ecr，通过调节Ecr的表达，而影响蜜蜂蜕皮激的素含量，进而影响蜂王产卵。2018年,研究人员对蜜蜂circRNA进行分析发现，环状RNA circ_16640含有miR-14序列结合位点，能够竞争性地吸附miR-14[32]。研究推测，环状RNA circ_16640可能通过序列结合位点吸附miR-14，解除miR-14对Ecr的抑制作用，进而促进蜕皮激素的合成、促进蜂王的卵巢激活和产卵启动[32]。3种RNA形成circRNA-miRNA-mRNA的互作网络，对生物过程发挥作用。关于lncRNA与编码RNA的相互作用，有研究发现，lncRNA XLOC_073978能够与Ecr下游基因Obp10相互作用，进而影响蜜蜂繁殖相关过程。更多关于编码RNA与非编码RNA之间的相互作用有待进一步的研究。

4 展望

本文综述了mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA在蜜蜂卵巢激活、产卵等繁殖活动中的作用，这些RNA表达的升高或降低与蜜蜂卵巢激活、产卵调控等过程密切相关。通过基因标记、调节RNA的表达水平等，可实现调控或影响蜜蜂的繁殖活动。但是目前仍有许多问题亟待解决，例如，如何应用载体增加蜜蜂繁殖组织mRNA和ncRNA的表达，外源性补充的ncRNA与内源性ncRNA发挥作用的方式是否相同，如何针对特异性的细胞调控mRNA和ncRNA的表达等，这些问题都需要分子生物学实验探索解决。蜜蜂繁殖组织mRNA和ncRNA的研究对于阐明蜜蜂繁殖性状的分子遗传机制意义重大，也为提高蜜蜂繁殖性能、进而提高养蜂经济效益奠定基础。蜜蜂繁殖性状相关RNA的研究中，关于mRNA和miRNA对蜜蜂卵巢激活的研究最多，但是关于lncRNA和circRNA在蜜蜂繁殖性状中的研究才刚刚起步，更多在蜜蜂繁殖活动中发挥关键作用的lncRNA和circRNA亟需被发掘与研究。不管是编码RNA还是非编码RNA，其在蜜蜂繁殖过程中的功能研究都还有很长的路要走。