盐胁迫对蒙桑种子萌发及幼苗生长的影响

闫晶秋子, 李钢铁*, 王月林, 麻云霞, 杨颖

(1.内蒙古农业大学沙漠治理学院, 呼和浩特 010018; 2.内蒙古自治区草原工作站, 呼和浩特 010017)

土壤盐渍化是因人类活动或自然引起的一种重要环境问题，全世界约有3.8亿hm2的土壤受到盐渍化的威胁，占可耕地面积的10%[1]。在我国，盐渍土总面积约为3 300万hm2[2]，其中盐荒地2 600万hm2，次生盐渍化土壤700万hm2，约占可耕地面积的25%[3-4]。不断加剧的土壤盐渍化问题，严重威胁着农区农业生产力，制约农林业生产发展和生态环境的改善。因此，确定水土保持树种耐盐范围，种植耐盐抗盐植物是改善土壤盐渍化，提高农林业生产能力的主要有效措施。

蒙桑(MorusmongolicaSchneid.)广泛分布于我国华北、东北、西北等地区，其生长迅速，植株高大，枝繁叶茂，适应性强，是防风固沙的优良树种[5]。此外，蒙桑材质坚硬，供制器具，树皮用于纤维造纸及人造棉原料，根皮、果实可入蒙药，茎、叶可制成动物饲料[6]。目前，蒙桑逐渐成为我国北方改造土壤盐渍化的主要树种之一，但关于蒙桑抗逆性方面的研究却少有报道，特别是蒙桑抗盐性方面的研究尚未见报道。

种子萌发到成长为幼苗是植物生命期中极为脆弱且关键的时期，是植株建成、成林质量、保持自身繁衍的主要环节[7]。而种子能够在盐胁迫条件下吸胀萌发是植株适宜在盐碱地种植的基本条件，所以，种子萌发时期是对植物进行耐盐性评价的重要时期。故本试验采用中性盐NaCl进行胁迫处理，研究不同盐浓度胁迫对蒙桑种子萌发特性及幼苗生理指标的影响，探索盐胁迫条件下蒙桑种子萌发及幼苗生长与土壤中盐分的关系，为培育和保护抗盐植物资源提供背景信息，为盐碱地带植物种群的重建和植被恢复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试蒙桑种子采于内蒙古农业大学校园内(E 111°71′12″，N 40°81′17″)。2018年6月初，采摘成熟落地的桑果，带回实验室，将桑果充分揉搓，水选剔除空粒和杂质后，自然风干备用。

1.2 试剂

根据李思远[8]的调查研究，内蒙古自治区呼和浩特地区的盐碱土大都为碳酸盐渍土，pH为9.19～9.76，可溶性盐总质量分数为0.157 6%～0.349 8%。对该地区碳酸盐渍土环境进行检测，得到不同盐碱摩尔配比为NaCl：MgCl2：CaCl2：Na2SO4：NaHCO3：Na2CO3=19.00∶1.27∶1.00∶10.00∶2.63∶2.37。本试验为简化试验设计，选取碳酸盐渍土中含量最多的NaCl为处理试剂，购自天津市致远化学试剂有限公司。

1.3 种子萌发胁迫处理

选取颗粒饱满、形状大小均一的成熟蒙桑种子，消毒洗净后，将50粒种子置于放有2层滤纸，直径12 cm的培养皿中。取不同浓度的NaCl溶液或蒸馏水10 mL，使滤纸浸透。盖上培养皿盖，之后每天定时更换培养皿并补充NaCl溶液及蒸馏水，保证各培养皿盐浓度不变。试验共设置6个处理，包括0(蒸馏水对照)、20、30、50、70、100 mmol·L-1NaCl溶液，每个处理重复3次。将培养皿放入GZX-250型光照培养箱(北京凯迪莱特仪器设备有限公司)内，温度30 ℃，连续光照培养15 d。

1.4 幼苗生长胁迫处理

将蒙桑种子浸泡于28 ℃清水中，进行48 h催芽处理后，播种于以干净河砂为基质，高15 cm，直径12 cm的花盆内。1个月后，选取长势相同幼苗18盆，每盆留30株，随机分为6组，量取100 mL浓度为0、20、30、50、70、100 mmol·L-1的NaCl溶液进行处理，利用称重法定时补充花盆损失水分，保证盐浓度不变。每组重复3次，共18个处理，连续胁迫处理15 d。

1.5 指标测定

1.5.1种子指标测定 种子千粒重：称取1 000粒种子的重量，重复3次，取平均值。

种子大小：利用毫米纸，测量100粒种子的长轴和短轴，取平均值。

种子活力：根据国家标准GB2772-81《林木种子检验方法》[9]，随机选取蒙桑种子100粒进行TTC法活力测定，并统计结果。

测定出供试材料千粒重为(9.152 1±0.000 5) g，种子长轴长为(1.202 1±0.001 0) mm，短轴长为(0.551 4±0.001 5) mm，且种子活力在90%以上。

1.5.2生长指标测定 以胚根长度达种子长轴的1/2视为发芽，每天早上8:30观察，记录种子萌发数，并测量胚根、胚芽长度。

萌发率(germiantion rate，Gr)=n/N×100%

式中，n为萌发种子数，N为播种种子数[10]。

发芽指数(germination index，Gi)=∑(Gt/Dt)

式中，Gt为第t日的萌发数，Dt为相应的萌发天数。

活力指数(vitality index，Vi)=S×Gi

式中，S为胚根长度加胚轴长(cm)[11]。

生长速率=L/∑[Ni×(Dt-Di+0.5)]

式中，L指每一培养皿全部萌发种子胚根长度的总合；Ni指第i天的萌发种子数；Dt指实验持续的天数(15 d)，Di指第i天[12]。

根伸长抑制率=(对照胚根长-处理胚根长)/对照胚根长×100%

芽伸长抑制率=(对照胚芽长-处理胚芽长)/对照胚芽长×100%

耐盐指数=Vi盐/Vi水×100

式中，Vi盐为盐胁迫下的萌发活力指数，Vi水为对照下的萌发活力指数[13]。

相对盐害率[14]=(对照萌发率-处理萌发率)/对照萌发率×100%

耐盐临界值：将NaCl浓度与上述生长指标进行相关分析，如果存在相关性，进行回归分析，根据回归方程得到相应生长指标的耐盐临界值。耐盐临界值的判断标准[15]为：若所测指标与盐浓度为正相关关系，则其耐盐临界值是对照增加200%时所对应的值，若所测指标与盐浓度为负相关关系，则其耐盐临界值是对照降低50%时所对应的值。

1.5.3生理指标测定 丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法[16]，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性测定采用NBT还原法[17]，可溶性糖(soluble sugar，SS)含量的测定采用蒽酮比色法[16]，脯氨酸(proline，Pro)含量的测定采用茚三酮显色法[16]，可溶性蛋白质(soluble protein,SP)含量的测定采用考马斯亮蓝法[16]，膜透性(相对电导率)的测定采用浸泡法[18]，叶绿素(chlorophyll，Chl.)含量测定采用紫外分光光度法[16]。

上述生理指标均使用UV759紫外可见分光光度计(上海奥普勒仪器有限公司)进行测定。

1.6 数据分析

利用Microsoft excel 2010进行数据分析和处理，SPSS 20.0 软件进行方差分析、回归分析及显著性检验，相关性分析采用Pearson法，多重比较采用Duncan法。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫对蒙桑种子萌发的影响

不同NaCl浓度下蒙桑种子萌发结果(图1)表明，随NaCl浓度不断升高，蒙桑种子萌发率、发芽指数、活力指数均出现不同程度下降，且各处理与对照均存在显著性差异。与对照相比，20、30、50、70、100 mmol·L-1的NaCl处理的萌发率分别下降13.95%、37.21%、41.86%、48.84%、51.05%；发芽指数分别下降21.36%、45.06%、49.02%、55.45%、59.08%；活力指数分别下降59.41%、79.41%、81.76%、95.29%、98.08%；说明盐溶液抑制蒙桑种子萌发，降低其活力。

注：不同字母表示同一指标不同处理间差异在P<0.05水平具有统计学意义。Note：Different letters of the same index indicate significant difference among treatments at P<0.05 level.图1 不同浓度NaCl溶液对蒙桑种子萌发的影响Fig.1 Effects of different concentrations NaCl solution on germination of M. mongolica seeds

种子萌发率体现特定环境下种子的生活力，发芽指数和活力指数则综合了发芽时间和胚根生长情况两方面特征，全面反映种子活力及其幼苗生长发育情况。图1说明，盐胁迫不仅抑制蒙桑种子吸水萌发，还影响幼苗胚根、胚芽的正常生长，大大降低蒙桑种子发芽指数和活力指数，进一步影响蒙桑种子发育成苗。

2.2 NaCl胁迫对蒙桑种苗生长的影响

2.2.1NaCl胁迫对蒙桑种子胚根、胚芽生长的影响 植物胚根的伸长程度是植物是否可以成苗的关键。如表1所示，经过15 d胁迫，胚根长度随NaCl浓度的升高不断降低，且除了30 mmol·L-1和50 mmol·L-1胁迫下，其余各组间均存在显著性差异，胚根长度由对照组的32.53 mm下降到100 mmol·L-1时的1.47 mm，下降95.48%；当NaCl浓度不断增加时，胚根生长速度逐渐变缓，除20 mmol·L-1胁迫下与对照差异不显著，其余各组均有显著性差异，胚根生长速度由对照组的0.65 mm·d-1降至100 mmol·L-1时的0.26 mm·d-1，放缓近60%。根、芽伸长抑制率从侧面反映NaCl浓度对种子生长的影响。表1可以看出，根、芽伸长抑制率随NaCl浓度的升高逐渐增大，当NaCl浓度为100 mmol·L-1时，根、芽伸长抑制率达到最大值，分别为95.48%和69.64%。充分说明，盐浓度升高抑制胚根、胚芽伸长发育，蒙桑种子抗盐能力一般。

表1 不同浓度NaCl溶液对蒙桑种子胚根、胚芽的影响Table 1 Effects of different concentrations NaCl solution on radicle and plumule of M. mongolica seeds

将盐胁迫浓度与各指标之间进行相关性分析，所得结果(表2)可以看出发芽率、活力指数、胚根长度、胚根生长速度与盐胁迫浓度呈显著负相关关系，计算得盐胁迫下发芽率、活力指数、胚根长度、胚根生长速度的耐盐临界值分别为2.55、59.71、2.42、0.67 mmol·L-1(表3)。

表2 蒙桑种子、幼苗指标与盐浓度的相关关系Table 2 Correlation analysis between seed and seedling indexes of M. mongolica and NaCl concentration

表3 蒙桑种子、幼苗指标与盐浓度的回归方程Table 3 Regression equation of M. mongolica seed and seedlings indexes and salt concentration

2.2.2NaCl胁迫对蒙桑种子耐盐指数和相对盐害率的影响 种子耐盐指数和相对盐害率分别表示种子对盐胁迫的耐受程度和种子遭受盐胁迫时的损害程度。如表4所示，随NaCl浓度升高，蒙桑种子耐盐性大幅降低。当NaCl浓度为20 mmol·L-1时，其耐盐指数降低至对照的50%；100 mmol·L-1时，耐盐指数低至1.92，与对照相比，下降98%。当NaCl浓度由20 mmol·L-1增加至100 mmol·L-1时，蒙桑种子均受到显著伤害。

表4 不同NaCl浓度对蒙桑种子耐盐指数、相对盐害率的影响Table 4 Effects of different NaCl concentrations on salt tolerance index and relative salt damage rate of M. mongolica seed.

2.3 NaCl胁迫对蒙桑幼苗生理指标的影响

2.3.1NaCl胁迫对蒙桑幼苗丙二醛及SOD活性的影响 不同处理的蒙桑幼苗丙二醛含量结果(图2)表明，随着NaCl浓度的升高，蒙桑幼苗MDA含量呈上升趋势， 与对照相比，20、30、50、70、100 mmol·L-1NaCl处理的MDA含量分别上升2.09%、9.24%、11.78%、15.73%和16.67%。除20 mmol·L-1NaCl溶液外，其余处理与对照均存在显著性差异。

随NaCl浓度升高，蒙桑幼苗SOD活性上升后大幅下降(图2)。30 mmol·L-1NaCl溶液胁迫下，SOD活性达到最大值，为51.05 U·g-1·min-1，比对照上升1.82%，但没有显著性差异；50 mmol·L-1NaCl处理SOD活性即显著下降，至100 mmol·L-1NaCl处理，SOD活性降为39.66 U·g-1·min-1，比对照下降20.88%。说明，盐胁迫可诱导蒙桑幼苗叶片过氧化酶活性，盐溶液达到50 mmol·L-1以上，蒙桑幼苗SOD活性受到显著抑制，影响蒙桑幼苗的生长发育。

注：不同字母表示不同处理间差异在P<0.05水平具有统计学意义。Note：Different letters indicate significant difference among treatments at P<0.05 level.图2 不同浓度NaCl处理对蒙桑幼苗MDA和SOD活性的影响Fig.2 Effects of different NaCl concentrations on MDA content and SOD activity of M. mongolica seedlings.

2.3.2NaCl胁迫对蒙桑幼苗渗透调节物质的影响 不同处理的蒙桑幼苗渗透调节物质结果(图3)表明，随NaCl浓度升高，蒙桑幼苗可溶性糖、可溶性蛋白质、脯氨酸含量均呈上升趋势。100 mmol·L-1NaCl胁迫下，SS含量最高，为8.19 mg·g-1，与对照相比，显著上升53.22%；50 mmol·L-1NaCl溶液胁迫下，SS含量为5.36 mg·g-1，与对照无显著性差异。20、30、50、70、100 mmol·L-1的NaCl处理的SP含量分别较对照显著上升5.18%、8.59%、12.14%、15.62%和19.17%，Pro含量分别显著上升14.22%、36.37%、64.31%、85.66%和92.90%。说明在盐胁迫环境下，蒙桑幼苗利用渗透调节物质的积累来调节和平衡体内的渗透压，以缓解盐胁迫带来的不利影响。

注：不同字母表示不同处理间差异在P<0.05水平具有统计学意义。Note：Different letters indicate significant difference among treatments at P<0.05 level.图3 不同浓度NaCl处理对蒙桑幼苗可溶性糖、可溶性蛋白质和脯氨酸含量的影响Fig.3 Effects of different NaCl concentrations on soluble sugar, soluble protein and proline content of M. mongolica seedlings.

2.3.3NaCl胁迫对蒙桑幼苗膜透性及叶绿素的影响 由图4可知，随NaCl浓度升高，蒙桑幼苗相对电导率呈阶梯状上升，Chl.含量呈下降趋势。20、30、50、70、100 mmol·L-1NaCl处理的相对电导率较对照分别上升7.67%、15.75%、27.38%、47.33%和62.09%，且达到显著性差异；Chl.含量分别下降9.63%、28.03%、29.06%、37.44%、43.42%。说明在NaCl溶液胁迫下，蒙桑幼苗细胞膜受损，电解质渗透量不断加大，叶绿素合成受到抑制，幼苗光合能力下降。

注：不同字母表示不同处理间差异在P<0.05水平具有统计学意义。Note：Different letters indicate significant difference among treatments at P<0.05 level.图4 不同浓度NaCl处理对蒙桑幼苗相对电导率和叶绿素含量的影响Fig.4 Effects of different NaCl concentrations on relative conductivity and chlorophyll content of M. mongolica seedlings.

3 讨论

随NaCl浓度升高，蒙桑种子的萌发能力和活力均大幅下降，这与前人在梭梭[19]、黄瓜[20]、黑果枸杞[21]、桑[22]种子盐胁迫中的研究结果一致。本研究认为，通过蒙桑种子的萌发率、发芽指数、活力指数这3个指标可以直接反应出其抗盐胁迫能力的强弱。结果表明，当NaCl浓度为20 mmol·L-1时，除胚根生长速度这一指标与对照差异不显著，萌发率、胚根长度、发芽指数、活力指数、耐盐指数、相对盐害率、根伸长抑制率、芽伸长抑制率这8项指标，与对照均存在显著性差异，说明蒙桑种子对NaCl浓度变化非常敏感。耐盐临界值的分析说明，蒙桑种子的胚根长度对NaCl浓度变化较为敏感，其次为活力指数和发芽率，胚根生长速度最不敏感，这与刘宝玉等[15]的研究结果一致，但与李志萍等[23]在盐胁迫对栓皮栎种子萌发及幼苗生长的影响中所得研究结论不一致，可能是与栓皮栎种子种皮较厚，盐溶液渗透需要时间较长有关。本研究结果表明，蒙桑种子最小耐盐临界值为0.67 mmol·L-1。祝娟娟等[24]研究测得河南桑和粤桑耐盐临界值分别为0.54 mmol·L-1和0.62 mmol·L-1，张国英[25]测得丰驰桑种子耐盐临界值为0.59 mmol·L-1，均小于本试验测得结果。程波等[26]在NaCl浓度为100 mmol·L-1时，测得“冰驰”苜蓿种子耐盐临界值为0.78 mmol·L-1，略大于蒙桑种子耐盐临界值，说明蒙桑种子抗盐碱性次于“冰驰”苜蓿种子。综上所述，蒙桑种子具有较强的抗盐性，适宜在中度盐胁迫下环境种植。与同属的河南桑、粤桑和丰驰桑等相比，均表现出较好的耐受性。

植物在盐胁迫环境下，膜系统是植物盐害的主要部位。细胞膜受到损害，将产生大量MDA[27]，细胞液中有机渗透物质流出[28-29]，与此同时，植物体内的保护酶系统被激活，SOD便是其中重要成员之一[30]。本研究结果表明，随着盐胁迫程度不断增加，蒙桑幼苗体内的SOD酶活性呈先升高后降低趋势，而MDA含量和相对电导率逐渐升高，说明在30 mmol·L-1NaCl溶液胁迫下，蒙桑幼苗的保护酶活增强，提高了幼苗清除自身活性氧的能力，减轻了膜脂过氧化程度。因此，蒙桑幼苗在NaCl浓度为30 mmol·L-1胁迫下，MDA含量升高，但与对照不存在显著性差异。当NaCl浓度升高为50 mmol·L-1时，超出蒙桑幼苗的抗盐能力，其体内过多积累的活性氧对保护酶造成损害，使SOD等保护酶活性降低，造成并加剧膜脂过氧化强度和膜系统伤害的程度[31-32]。

渗透调节是植物在逆境胁迫下的一种非常重要的自我生理保护机制。在盐胁迫环境下，细胞发生渗透，植物体通过提高自身有机渗透调节物质含量，使细胞内渗透势降低，增强抗盐能力。其中有机渗透调节物质主要包括可溶性糖、可溶性蛋白质以及脯氨酸。可溶性糖对植株保持自身活力及维持细胞膜稳定具有很大作用[33]；可溶性蛋白质的多少说明植物体的代谢状况；脯氨酸起到细胞质内渗透调节的作用，帮助植物减缓外界胁迫伤害[34]。大量研究表明，盐胁迫处理后植物体内有机渗透调节物质含量明显升高[35-37]。本试验中，随NaCl浓度升高，蒙桑幼苗可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量和脯氨酸含量均显著性升高。由此可知，在盐胁迫环境下，蒙桑幼苗可通过调节自身的渗透有机质，使体内渗透压降低，以便适应外界环境。

已有研究表明[38-39]，农桑14号、农桑12号、湖桑32号以及白榆幼苗在NaCl浓度为100 mmol·L-1时，便出现植株萎蔫，叶片尖端甚至整片叶泛黄，部分植株死亡的现象，林兴生等[40]试验表明，当NaCl浓度为100 mmol·L-1时，“稗草”、“莱竹”2种菌草叶片均呈失绿症状，死亡率为40%。而本试验结果说明，蒙桑幼苗在盐浓度为100 mmol·L-1时，生长发育良好，无死亡植株，且没有萎蔫泛黄现象，说明蒙桑幼苗具有较强的抗盐能力。

综上所述，在盐胁迫条件下，蒙桑种子的萌发和幼苗的生长均受到抑制。蒙桑种子在NaCl溶液浓度大于0.67 mmol·L-1环境下生长培育，便受到盐胁迫的损害，但蒙桑种子通过胚芽短小卷粗、胚根缩短增粗抵御盐胁迫。对于幼苗而言，随着盐胁迫程度不断加深，蒙桑幼苗启动自身防御机制，通过提高SOD等保护酶活性，降低由MDA含量积累造成的膜脂过氧化程度。可溶性糖、可溶性蛋白质和脯氨酸的积累，可调节细胞渗透势，降低盐胁迫对蒙桑幼苗的伤害程度，保护原生质，防止细胞失水，保护生物大分子结构与功能的稳定。相对电导率和叶绿素能直接反映出处理期间盐胁迫对蒙桑幼苗的伤害程度，研究表明，当细胞膜系统遭到破坏，随着胁迫时间延长，蒙桑幼苗叶片出现轻微萎蔫的现象。根据李思远[8]对碳酸盐渍土含盐量调查，结合本试验结果，可以看出，在碳酸盐渍土地区，通过播种繁殖培育蒙桑较为困难，而蒙桑幼苗具有良好的抗盐性，可通过移植、无性繁殖等繁育方式对蒙桑幼苗进行培育，形成规模，有利于改良土壤成分。本研究为今后深入研究蒙桑资源耐盐性评价，筛选和培育耐盐碱品种以及制定耐盐碱栽培措施提供参考依据。