马来穿山甲多种菌混合感染的细菌分离鉴定及小鼠的毒力试验

张安洁,杨 勇,肖望成,徐孝青,曾邦权,肖 啸,代飞燕∗,秦 莉 (.云南农业大学 动物医学院学院,云南 昆明6500;.云南省动物疫病预防控制中心,云南 昆明6500;3.昆明学院 农学院,云南 昆明6504)

马来穿山甲(pangolin Malay)也称爪哇鲮鲤、马来钻山甲,是鳞甲目物种,主要分布于中南亚国家。其嗅觉灵敏、视力弱、免疫器官不发达。是一种珍稀药用动物。李时珍在《本草纲目》中就有记载:“鳞可治恶疮、疯症、痛经、利乳[1]。”2007 年,国际自然与自然资源保护联盟和保护国际经过评估,马来穿山甲从低危调整为濒危等级[2]。目前关于马来穿山甲的报道仅30篇,多为研究其繁殖、年龄及种群结构,而对于疾病诊断方面仅有1例,即陶立等[3]发表的1起穿山甲疫情的病原分析。所以本试验为我们了解马来穿山甲及肠道致病菌提供了重要的临床经验,也为我们后期保护马来穿山甲提供了及其重要的理论依据。

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是克雷伯菌属中最为重要的一类细菌,致病性在克雷伯菌属中最强,存在于人体的上呼吸道和肠道,可引起肺炎、呼吸道及泌尿道感染、腹泻、败血症等[4];变形杆菌(Proteus species)属肠道的正常菌群,是引起医源感染的重要条件致病菌[5],广泛分布于人和动物的体表、黏膜及消化道,其产生的毒素可引起中毒,是一种常见的条件性致病菌[6];弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter)属肠杆菌科枸橼酸杆菌属,有11个基因种。其中,弗氏柠檬酸杆菌、布氏柠檬酸杆菌和科氏柠檬酸杆菌常与人和动物的感染有关[7],近年来,该菌引起鱼、虾、鳖、蟹等水产动物感染发病的报道较多[8]。另外,小鼠、爬行动物及鸟类也会发生柠檬酸杆菌感染,并可通过粪便将病原菌排出体外。感染其他动物,严重者死亡。大肠杆菌O83∶H1(Eheco83∶h1)是一种黏附性侵袭性大肠杆菌,主要定植并黏附于肠上皮细胞,引起肠道的某些慢性炎症,腹泻等症状。

1 材料与方法

1.1 样品来源2017年9月云南省宜良某野生动物收容中心收容了5只马来穿山甲,都有严重的腹泻症状,粪便呈黑绿色、且带有脱落的肠黏膜,其中2只并发打喷嚏及呼吸困难等症状。本试验无菌采集5只穿山甲的粪便棉试子及2份有呼吸道症状的鼻腔棉拭子。

1.2 主要试剂普通肉汤培养基、普通琼脂培养基、血液营养琼脂培养基、生化试剂盒购自广州环凯微生物科技有限公司、DNA 提取试剂盒购自云南晨绿生物科技有限公司、药敏片购自杭州滨和微生物试剂有限公司、核酸染色剂购自大连宝生物有限公司。

1.3 试验动物昆明SPF 小鼠,6 周龄,体质量18～25 g,购买自昆明医科大学实验动物中心。

1.4 细菌分离鉴定采用三角区平板划线法将细菌接种于普通琼脂培养基和血液营养琼脂培养基上,37℃恒温培养18～24 h。挑选出不同形态大小的菌落,分别混与装有2 000～3 000μL肉汤的试管内培养。该试验共挑选出5种形态不同的菌落,其中2种分离自鼻腔棉试子,标记为ƒ-1、ƒ-2;另外3种分离自粪便棉试子,标记为ƒ-3、ƒ-4、ƒ-5。

1.5 生化试验将纯培养株菌分别接种于生化管内。观察并记录生化结果,参考《伯杰细菌鉴定手册》进行比对。

1.6 菌株的16S rDNA PCR 鉴定参照所购试剂盒标准提取5株菌的核酸,将其作为PCR 模板。采用细菌16S r DNA 的通用引物(27 F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1 492 R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),对 菌 株 的16S r DNA 进行PCR 扩增、琼脂糖凝胶电泳、测序鉴定,测序结果在NCBI上进行比对,结果表明ƒ-2与ƒ-5为同一种菌,选择ƒ-2进行接下来的试验。并获取与分离菌株16S r DNA 序列最相近的序列。采用MEGA3.0软件,邻接法构建系统进化树,重复取样1 000次进行自展值分析[9]。

1.7 药敏试验在无菌操作台内将扩增好的菌液分别吸取200μL注入普通琼脂培养基内,用无菌三角棒将其涂布均匀,每种菌挑选10种药敏片按标准纸片琼脂扩散法(K-B法)对分离的4株细菌进行药敏试验[10]。

1.8 动物毒力试验此次毒力试验分为4 组,ƒ-1为1组、ƒ-2为2组、ƒ-3为3组、ƒ-4为4组。预试验每个组分为4小组,每小组4只体质量相近的小鼠且雌雄各半,正式试验每组分7个小组,每小组6只体质量相近的小鼠且雌雄各半。挑取经纯化鉴定的ƒ-1菌液至2 m L的肉汤中,37℃恒温摇床培养12 h。利用微量分光光度计计算出菌液浓度为2.5×1012CFU/m L,将原菌液100 倍稀释3 个梯度(2.5×1010,2.5×108,2.5×106CFU/m L)进行预试验,将原菌液及稀释3个梯度的菌液分别腹腔注射给1组预试验的4组小鼠,每只小鼠0.5 m L,24 h观察小鼠的死亡情况,得出引起动物0%和100%死亡的剂量分别为2.4×106,2.4×1010CFU/m L。正式试验在预试验的剂量范围内5倍稀释6个梯度,分别为1.20×107,6.00×107,3.00×108,1.50×109,1.25×1010,7.25×1010CFU/m L,将6个梯度的菌液分别注射给1 组正式试验的6 组小鼠,每只小鼠0.5 m L,另外1组作为对照组每只小鼠腹腔注射0.5 m L生理盐水,观察1周内小鼠的死亡情况。以同样的方法对ƒ-2、ƒ-3、ƒ-4菌液进行预试验得出ƒ-2、ƒ-3、ƒ-4引起动物0%和100%死亡的剂量分别为7.2×105,7.2×109;8×106,8×1010;3.6×109,3.6×1013CFU/m L。正式试验同上,在预试验的剂量范围内4倍稀释6个梯度进行人工感染小鼠,观察1周内小鼠死亡情况(表1)。

表1 梯度稀释菌液浓度 CFU/m L

1.9 目的菌株的回收与鉴定将死亡小鼠进行解剖,取病变较为明显的部位进行实验室细菌分离鉴定培养和测序鉴定。

2 结果

2.1 细菌菌落形态参照常见细菌系统鉴定手册观察菌株[11]。ƒ-1在普通培养基上培养12～18 h的细菌,生长为灰白色凸起,挑之易拉成丝的菌落;ƒ-2在血平板上有溶血现象;ƒ-3在普通培养基上生长为低突、灰色半透明、边缘整齐而光滑的菌落;ƒ-4在普通琼脂培养基上生长为平滑、乳白色菌落。

2.2 镜检结果ƒ-1为革兰阴性粗短杆菌,单独、成双或短列状排列;ƒ-2为革兰阴性两端钝圆的小杆菌;ƒ-3为革兰阴性椭圆形短杆菌;ƒ-4为革兰阴性长杆菌(图1～4)。

图1 ƒ-1镜检结果(100×)

图2 ƒ-2镜检结果(100×)

图3 ƒ-3镜检结果(100×)

图4 ƒ-4镜检结果(100×)

2.3 生化试验结果ƒ-1与葡萄糖、甘露醇、H2S等反应为阳性,与鸟氨酸脱氢酶、甲基红等反应为阴性;ƒ-2与葡萄糖、H2S、乳糖等反应为阳性,与鸟氨酸脱氢酶、甘露醇等反应为阴性;ƒ-3与葡萄糖、鸟氨酸脱氢酶、甘露醇等反应为阳性,与氧化酶、吲哚等反应为阴性;ƒ-4与氧化酶、吲哚乳糖等反应为阳性,与甲基红、H2S等反应为阴性(表2)。

表2 生化试验结果

2.4 16S r DNA 扩增及系统发育分析通过PCR扩增菌株的16S r DNA 片段,与预期片段一致(图5)。将ƒ-1、ƒ-2、ƒ-3、ƒ-4的序列分别提交到NCBI的GenBank数据库,获得的序列号依次为KF974479.1,HQ259933.1,MF148471.1,NC_017634.1,采 用BLAST 进行比对,得出ƒ-1的序列与肺炎克雷伯菌的相似性最高、ƒ-2与变形杆菌Z2株的相似性最高、ƒ-3与弗氏柠檬酸杆菌的相似性最高、ƒ-4与大肠杆菌O83∶H1的相似性最高,且同源性都在99%;每种菌选择3～4株相关菌株,以链球菌作为外群,构建系统进化树(图6)。ƒ-1与肺炎克雷伯菌聚为一簇,ƒ-2与变形杆菌聚一簇,ƒ-3与柠檬酸杆菌聚一簇且与弗氏柠檬酸杆菌最接近,ƒ-4与大肠杆菌聚一簇且与大肠杆菌O83∶H1最接近,由此确定ƒ-1为肺炎克雷伯菌、ƒ-2为变形杆菌、ƒ-3为弗氏柠檬酸杆菌、ƒ-4为大肠杆菌O83∶H1。

2.5 药敏结果肺炎克雷伯菌和变形杆菌对头孢三代及链霉素的敏感性较高,对喹诺酮类耐药;大肠杆菌O83∶H1对喹诺酮类及新霉素敏感性好,对庆大霉素、卡那霉素、链霉素耐药;弗氏柠檬酸杆菌对大观霉素及头孢三代敏感性较好,对喹诺酮类和青霉素类耐药(表3)。

图5 4株菌株PCR 扩增结果 M.DL2000 DNA Marker;1.ƒ-1;2.ƒ-2;3.ƒ-3;4.ƒ-4

2.6 动物试验肺炎克雷伯菌人工感染小鼠结果显示,在感染后8 h,小鼠开始出现精神沉郁、不愿走路、畏寒、喜蜷缩,10 h后出现呼吸困难呈憋喘状,12 h后出现1只死亡,16 h后出现4只死亡,24 h后1.500×109CFU/m L 及以上组别6只小鼠全部死亡。变形杆菌在感染后8 h小鼠出现背毛粗乱、颤抖扎堆,12 h后出现腹泻症状,16 h后1只小鼠死亡,24 h 后3 只 小 鼠 死 亡,48 h 后2.250×109CFU/m L 及以上组别6只小鼠全部死亡。弗氏柠檬酸杆菌在感染8 h后小鼠出现精神萎靡、采食下降,18 h后出现腹泻,24 h后1只死亡,36 h后4只死亡,48 h后2.500×1010CFU/m L及以上组别6只小鼠全部死亡。大肠杆菌O83∶H1在感染12 h后小鼠出现精神萎靡、背毛粗乱、扎堆等现象,24 h后出现1死亡,36 h后出现3只死亡,48 h后出现4只死亡,60 h后6.125×1013CFU/m L 组别6只小鼠全部死亡,通过改良寇法:log LD50＝X K-i(∑P-0.5)(X K为最高对数剂量,i为相邻两对数剂量的差值,∑P为个剂量组的死亡率之和)计算出肺炎克雷伯菌、变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌及大肠杆菌O83∶H1的LD50 分别为4.37×108,1.15×108,1.29×109,4.15×1012CFU/m L(表4,5)。

图6 16s r DNA 与相关细菌的系统发育树

表3 菌株药敏试验结果 mm

2.7 发病小鼠病理剖检与细菌分离鉴定剖解死亡小鼠,可见第1组小鼠肺脏、脾脏淤血肿胀、肝脏有坏死灶;第2组小鼠脾脏淤血肿大,肠系膜脱落、肠管变薄、有大量黄色透明的黏液性内容物;第3组小鼠肝脏和脾脏出现坏死;第4组小鼠肠系膜出现一定程度的炎症且充血。取上述病变组织分别进行细菌的分离培养及测序鉴定,结果与人工感染小鼠所使用的菌液相符。第1组为肺炎克雷伯菌、第2组为变形杆菌、第3组为弗氏柠檬酸杆菌、第4组为大肠杆菌O83∶H1。

3 讨论

目前有关马来穿山甲的报道极少,其肠道细菌分离鉴定未见报道。本次试验对于了解这4种菌在马来穿山甲上的致病性表现提供了科学依据。

相关报道表明,肺炎克雷伯菌主要存在于机体的呼吸道及痰液中,导致咳嗽、呕吐、腹泻、呼吸困难等症状,感染羊表现为眼睛红肿、咳嗽[13-15,23-24]。此次毒力试验感染昆明小鼠,表现出畏寒、喜蜷缩、呼吸困难呈憋喘状,说明该菌是导致马来穿山甲出现呼吸困难等症状的主要致病菌;变形杆菌感染猪导致食欲减少、体温升高、下痢等症状;感染扬子鳄引发尿酸盐沉积、肾病变等症状;感染水貂引发气喘、血沫、下痢等症状[16-18]。毒力试验感染小鼠剖解见肠系膜脱落、肠管变薄有浆液性渗出,说明该菌是引起马来穿山甲出现腹泻、肠黏膜脱落等症状的主要致病菌;弗氏柠檬酸杆菌是导致人和动物出现腹泻症状的病菌之一。据报道该菌可引发鱼类皮肤溃烂、腐败,肛门红肿出血等症状,引发猕猴、仔猪、东北虎腹泻,导致小寒尾羊急性败血症死亡,因为较强的菌株可穿过肠黏膜到达全身各个组织器官,导致机体广泛出血至败血症死亡[19-21]。该菌感染小鼠临床症状为精神萎靡、采食下降,剖解见脾脏、肝脏出现不同程度的坏死;大肠杆菌O83∶H1 主要定植并黏附于肠上皮细胞,引起肠道的某些慢性炎症,腹泻等症状。动物毒力试验剖解小鼠见肠系膜充血伴有炎症。

表4 肺炎克雷伯菌和变形杆菌人工感染小鼠死亡情况

表5 弗氏柠檬酸杆菌和大肠杆菌人工感染小鼠死亡情况

动物毒力试验结果表明,在此次细菌感染中,变形杆菌的致病性最强,其次是肺炎克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌,大肠杆菌O83∶H1 的毒力相对要弱一些,且变形杆菌是导致马来穿山甲出现腹泻、肠黏膜脱落等症状的主要致病菌,肺炎克雷伯菌是导致马来穿山甲出现呼吸困难等症状的主要致病菌,弗氏柠檬酸杆菌和大肠杆菌O83∶H1是导致马来穿山甲出现腹泻症状的主要致病菌,在2种菌的混合感染下穿山甲体内正常菌群失调,引起呼吸道和消化道的临床症状。

药敏结果,肺炎克雷伯菌和变形杆菌对头孢三代及链霉素的敏感性高,与杨小敏等[22]对肺炎克雷伯菌的药敏试验结果一致,与邓晶荣[25]对变形杆菌的药敏试验结果相比敏感性更高。弗氏柠檬酸杆菌对大观霉素及头孢三代敏感性较好,对喹诺酮类和青霉素类耐药,与ZONG 等[26]对弗氏柠檬酸杆菌的药敏试验结果相比敏感性低。大肠杆菌O83∶H1对喹诺酮类及新霉素敏感性好,目前未见有相关药敏报道。综上所述,本次药敏试验结果敏感性比报道中的高,推断可能是因为在马来穿山甲之前的生活中用药少或在发病时还未及时用药就被我们救助,机体未对抗生素产生广泛的耐药性。