籽鹅羽束性状在肝脏中相关候选基因关联性分析

张宇辰,李文杰,袁建彬,臧树成,王立鹏,朗立敏,陈 妍,杨焕民 (黑龙江八一农垦大学 动物科技学院,

黑龙江大庆163319)

籽鹅(zi-goose)是我国北方特有的家禽品种,其主要分布于我国黑龙江省松嫩平原,该品种能在寒冷和粗放的饲养条件下,仍能保持优良的产蛋性能。在禽类品种改良中,为理想的杂交母本品种。而在实际生产中,发现籽鹅出生时在其头顶有一簇明显的绒羽,该性状类似于水禽中的羽冠性状。但在观测中,籽鹅该性状较前者从形态、大小、绒羽密度上略有差异,在这里暂定为羽束性状。该性状在公、母鹅个体中均有,随着个体生长发育逐渐浓密而明显,通过观察发现,该性状具有3种表型,片状羽束、簇状羽束、球状羽束,在相关研究鹅的文献中并未见报道。同时,在禽类相关头部表型修饰性状中,如鸡冠、缨头等性状与家禽社会等级、配偶选择、产蛋性能等均有着关联性[1]。因此,通过对鹅羽束性状遗传规律的研究,也为后续鹅类在品种改良、性状选育等方面研究奠定基础。

本试验通过检测调控禽类头部表型性状的主效基因(eomes、hoxc8、sox5、mnr2)[2-5],以及引入可能在同一信号通路中的相关基因(wnt5a、bmp2、gh)[6-9],分析各时期肝脏组织中基因相对表达量,并结合禽类常见生物信息学分析方法,推测其对羽束性状起到的相关作用,同时进行相关机制探讨。从而进一步拓宽禽类表型修饰性状与调控基因的关联性,为后续禽类基因性状研究、分子遗传育种等提供理论基础[10-11]。

1 材料与方法

1.1 资源群体构建本试验选取同家系同世代1日龄籽鹅作为试验样本,构建2个资源群体,每群体60只。1号群体均为有羽束公雏,简称为有羽束鹅群(crest population,C);2号群体均为无羽束公雏,简称无羽束鹅群(non-crest,NC),将2个资源群体于黑龙江八一农垦大学鹅业研究所科研基地进行试验。同时,在试验基地随机选取11月龄有羽束公鹅(crest)和三花公鹅(non-crest)各15只。(三花鹅为我国南方品种,该鹅头部不具有羽束类型的表型修饰性状。)同舍分栏饲养,自由采食、饮水,雏鹅饲养周期为21 d,11月龄鹅饲养周期为7 d。

1.2 组织样本采集经上述条件进行试验后,在1,7,14,21日龄4个时期,在2个资源群体中,每次分别随机选取3 只雏鹅为试验样本,样本总量为24只。在11月龄有羽束鹅和三花鹅2个群体中,分别随机选取3只公鹅为试验样本。进行放血屠宰,迅速采取肝脏组织,并用DEPC 处理水洗净,放于液氮罐中冻存过夜,然后置于－80℃待测。

1.3 组织总RNA 提取将各时期肝脏组织,分别放入球磨仪(Retsch MM 400)型中研磨,然后加入TRIzol(Ambion公司)从组织中提取总RNA,并用核酸蛋白分析仪(NanoDrop 2000型)对所提RNA进行浓度测定,并保证各样本RNA 提取后D值(260/280 nm)在1.8～2.0之间。

1.4 cDNA 合成应用反转录试剂盒(Ta KaRa公司),结合PCR 扩增仪(美国ABI公司9700型)进行反转录,取5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL,g DNA Eraser 1.0μL,样本RNA 加量按1/总RNA 相对浓度(mg/L)添加,然后用RNase Free d H2O 补齐10.0μL体系,随后置于PCR 扩增仪中,反应条件为42℃,2 min。再加入5×PrimeScript Buffer 4.0μL,PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1.0μL,RT Primer Mix 1.0μL,RNA Free d H2O 4.0μL,组成20.0μL体系。反应条件为37℃,15 min;85℃,4℃循环保存。

1.5 q RT-PCR应用Primer Premier 5.0 软件,结合NCBI 网站中GenBank 系统,将本试验鹅的sox5、eomes、hoxc8、wnt5a、bmp2、gh基 因CDS区序列在线下载。而鹅的mnr2基因序列在NCBI网站中并没有发布,则本试验以鸡的mnr2基因CDS区作为序列模板,进行后续试验。设计引物交由上海生工生物技术有限公司进行合成,引物序列见表1。通过Real-time PCR 仪(Bio-rad CFX96型)进行基因表达量检测,应用25 μL 反应体系,其中SYBR®Premix ExTaqⅡ12.5μL,d H2O 9.5μL,模板cDNA 1.0μL Forward Primer 1.0μL,Reverse Primer 1.0μL。以β-actin作为内参基因,将有羽束鹅群和无羽束鹅群分别设为2组,分别是C、NC组,每个样本2个重复。同时,设2个空白重复,模板为1.0μL d H2O,其他条件不变,排除试验d H2O 污染现象。

表1 候选基因及内参基因引物序列

1.6 数据统计及生物信息学分析应用CFX96自带分析软件及生物学分析方法计算2－△△Ct值,采用SPSS19.0软件的t检验的方法,对样本的相对表达量显著性进行分析(P＜0.05为差异显著,P＜0.01为差异极显著),同时结合Graphpad Prism7进行作图直观分析。基于候选基因各时期在肝脏组织中相对表达量,结合Multiexperiment Viewer软件对候选基因在各时期肝脏组织中表达量数据进行聚类分析,并绘制聚类热图,进行基因关联性分析。

2 结果

2.1 qRT-PCR分析结果

2.1.1 雏鹅期在肝脏中基因不同时期相对表达量

如图1所示,图1A 为eomes基因在肝脏组织中1,7,14,21日龄C、NC 组相对表达量,各时期2个组相对表达量均不显著(P＞0.05),并且各组相对表达量成不规律变化趋势;图1B 为sox5基因在肝脏组织中1,7,14,21日龄C、NC 组相对表达量,在1日龄时,肝脏组织中C与NC 组sox5相对表达量差异极显著,P值为0.001 7(P＜0.01),而在其他时期差异并不显著(P＞0.05),但在各时期sox5基因相对表达量C 组均高于NC 组。图1C 为mnr2基因在肝脏组织中相对表达量分析,各时期C、NC 组相对表达量均无显著性差异,并且C、NC 组各时期相对表达量呈无规律变化。图1D 为wnt5a基因在肝脏组织中1,7,14,21日龄C、NC 组相对表达量,在1日龄时,肝脏组织中C 与NC 组wnt5a基因相对表达量差异极显著(P＜0.01),而其他时期差异并不显著(P＞0.05),在7,14日龄时C 组相对表达量均高于NC组,而在21日龄时C组相对表达量低于NC组,差异不显著。同时,C组wnt5a基因该时期相对表达量均低于其1,7,14日龄时期。图1E为bmp2基因在肝脏组织中1,7,14,21日龄C、NC 组相对表达量,2个组在各时期均无显著性差异(P＞0.05),但在1,7,14日龄时C 组相对表达量均高于NC组,而在21日龄时C 组表达量低于NC 组,同时C组bmp2基因该时期相对表达量均低于其1,7,14日龄时期。图1F为gh基因在肝脏组织中1,7,14,21日龄C、NC组相对表达量,2个组在各时期均无显著性差异(P＞0.05),变化趋势无规律。经试验分析,hoxc8基因在肝脏中未表达。

2.1.2 11月龄籽鹅、三花鹅在肝脏组织中基因相对表达量 如图2所示,A～F图分别为eomes、sox5、wnt5a、bmp2、mnr2、gh在11 月龄籽鹅、三花 鹅肝脏组织中基因相对表达量,sox5、wnt5a、bmp2基因在肝脏组中相对表达量籽鹅高于三花鹅,差异极显著(P＜0.01)。hoxc8基因在籽鹅、三花鹅肝脏组织中未表达。eomes、mnr2、gh基因在籽鹅、三花鹅肝脏组织中均有表达,mnr2基因相对表达量籽鹅高于三花鹅,差异不显著(P＞0.05)。eomes、gh基因相对表达量三花鹅高于籽鹅,均无显著性差异(P＞0.05)。

图1 籽鹅肝脏中不同时期基因相对表达量 A.eomes 在肝脏中不同时期相对表达量;B.sox 5在肝脏中不同时期相对表达量;C.mnr 2在肝脏中不同时期相对表达量;D.wnt 5a在肝脏中不同时期相对表达量;E.bmp 2在肝脏中不同时期相对表达量;F.gh在肝脏中不同时期相对表达量;∗.P＜0.05;∗∗.P＜0.01;∗∗∗.P＜0.001。下同

2.2 基因表达数据的聚类分析结果如图3所示,图3A 为羽束籽鹅肝脏中基因表达数据的聚类热图。将基因根据可能在同信号通路中分类,可分为2大类,eomes、sox5基因在同一信号通路中,mnr2、wnt5a、bmp2、gh基因在另一信号通路中。结合图可知,sox5基因在各日龄时期表达量较高,bmp2基因在1,7日龄时期表达量较高,随后逐渐降低。其他基因在肝脏组织中各日龄表达量均低于较sox5基因。图3B为无羽束籽鹅肝脏中基因表达数据的聚类热图。将基因根据可能在同信号通路中分类,可分为2大类,eomes、sox5、wnt5a基因在同一信号通路中,mnr2、bmp2、gh在另一信号通路中。结合图可知,sox5基因在各日龄时期表达量较高,同羽束鹅在肝脏中表达量结果相似,bmp2基因在1,7,21日龄时期表达量较高,在14 日龄表达量较低。其他基因在肝脏组织中各日龄表达量均较低。

3 讨论

wnt5a基因禽类在皮肤生长、毛囊发育、羽毛形成过程有着重要的调控作用[2],而在本研究中,发现1日龄时期(图1D),该基因在肝脏组织中,C组相对表达量高于NC组,差异极显著(P＜0.01)。同时,在成年鹅中,该基因在有羽束籽鹅肝脏组织中相对表达量高于三花鹅(non-crest)差异极显著(P＜0.01)。由此推测wnt5a基因在籽鹅生长发育过程起到相关调控作用[6]。同时,结合在羽束鹅基因聚类分析中(图3A),在羽束性状形成过程起到一定促进作用,该基因可能同sox5 基因在同一信号通路中[12-13],而该基因的表达,可能对羽束性状形成后的表型具有一定修饰作用[14-15]。2014年,李瑶等[16]在鹅胚胎期的表皮研究中发现,wnt5a基因前期主要在表皮和真皮中表达,在毛囊发育初期短暂推迟毛囊生长,而后期没有影响,在wnt5a相对表达量较低时,毛囊深快速发育。由此推断,在鹅毛囊生长前期,有羽束鹅该基因表达量高于无羽束鹅,此时,短暂抑制头部毛囊生长发育,在表皮及真皮部位相对表达量升高,从而影响有羽束鹅头部皮肤异位表达,随日龄增加该基因抑制不再明显,而通过与sox5基因互作[17-18],使有羽束性状个体呈现出不同形态,在无羽束鹅群中,该基因前期既没有抑制毛囊发育,促使头部异位表达,同时,在后期该基因促使毛囊深发育加快,使其头部羽毛正常生长,没有出现异位表达现象。

图3 籽鹅在肝脏中各时期基因表达聚类分析 A.羽束籽鹅肝脏中各时期基因表达聚类分析结果;B.无羽束籽鹅肝脏中各时期基因表达聚类分析结果;红色代表高表达基因,绿色表示低表达基因。颜色由红到绿,表示表达量由高到低

bmp2基因在禽类骨骼生长,软骨发育中起到重要作用[8,19],该基因在各时期肝脏组织中相对表达量C 组与NC 组比较均无显著性差异(P＞0.05),但在成年鹅中,该基因在肝脏组织中相对表达量有羽束籽鹅高于三花鹅(non-crest),差异极显著(P＜0.01)。同时,在无羽束鹅基因聚类分析中(图3B),发现该基因可能在肝脏发育、代谢过程中起到调控作用,与sox5基因关联性较强。由此推测该基因在羽束性状发育前期并未起到主要调控作用,而在羽束性状成型后期,间接参与调控过程,使该性状具有不同表型[7,20]。2012年,WANG 等[2]通过研究乌骨鸡缨头性状发现,BMPs家族中bmp7基因与hoxc8基因对成年乌骨鸡缨头性状具有互作效应,参与调控缨头性状的形成过程,这一结果也间接表明,bmp2作为BMPs家族中重要基因,可能在羽束性状形成过程具有关联性[8]。结合以上研究,均表明sox5、wnt5a、bmp2基因在羽束性状形成中具有一定关联性[6,17],通过在同信号通路中互作,或通过间接调控[21-22],在羽束性状生长发育过程中起到重要作用[23]。