甲基磺酸乙酯(EMS)对醉鱼草种子萌发的影响

(中南林业科技大学风景园林学院，湖南 长沙 410004)

醉鱼草(Buddlejalindleyana)又名“毒鱼草”、“痒见消”，为马钱科(Loganiaceae)醉鱼草属(BuddlejaLinn.)落叶灌木，花期4—10月，能“招蜂引蝶”，是园林中常用的优质观花灌木[1]。醉鱼草最早在《本草纲目》中有相关记载，由此可见，至少在公元 1578 年前，人们就已经对醉鱼草的药用价值进行了研究应用[2]。醉鱼草为多个省份的乡土植物，其生境要求低，适应性强，具有一定的抗旱、耐盐碱能力[3-5]，是改良土壤重金属污染及盐碱化的理想植物。实地调查发现，醉鱼草花开于枝顶，花期长，贯穿三季，但株形开散，姿态观赏性差，园林应用中常需对其进行不断地修剪，而修剪往往会剪去萌蘖花芽，从而降低其观赏效果。因而开展醉鱼草的种质创新和新品种选育对提高醉鱼草的观赏价值和改良土壤具有重要的意义。

甲基磺酸乙酯(EMS)诱变具有诱变频率高、诱变范围广以及诱变效率高等优点[6]。Klmark于1953年首次报道了EMS的诱导作用[7]。之后，EMS开始应用于植物、动物、真菌等多个领域[8-10]。据不完全统计，利用EMS诱变已育成了2 250个植物品种[11]。EMS作用后产生的显性性状比较多[12]，利用EMS进行物种诱变，是获得抗性植株、叶色、花色、株形等性状改变的重要手段[13-14]。目前，利用EMS诱变技术已在紫花苜蓿[15]、三角梅[16]、寒兰[17]、杉木[18]、白三叶[19]等植株上进行了研究，均取得了一定的成效。

当前，国内关于醉鱼草的研究主要集中在药用、抗逆性及扦插繁殖技术等方面[20-22]。国外学者对醉鱼草同属植物大叶醉鱼草进行了大量的杂交及诱变处理，已培育出众多新品种,如“SUMMER SKIES[23]”、“miss ruby[24]”、“Blue Chip[25]”等。醉鱼草分布范围广，遍布于我国12个省份[1]，但对于醉鱼草的品种改良及新品种的创制研究几乎处于空白阶段。因此，本实验利用EMS的不同浓度及处理时间对醉鱼草种子进行处理，以确定适宜的诱变浓度和时间，为醉鱼草的性状改良及种质创新提供基础材料，为日后大规模构建醉鱼草EMS诱变群体提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

醉鱼草种子于2018年12月底采自湖南省洋湖湿地公园，自然干燥后于4 ℃下保存，千粒重约0.037 5 g。

1.2 实验方法

1.2.1实验设计

选取颗粒饱满的醉鱼草种子6 300粒，50 ℃温水下预浸5 min后，加蒸馏水于25 ℃环境下浸种12 h。吸干种子表面水分，用0.1 mol·L-1，pH=7.0的磷酸缓冲液依次配制浓度为0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%，3.0%等共6个梯度的EMS溶液，设置12、24、48 h共3个时间梯度，pH=7.0的磷酸缓冲液处理作为对照，处理完成后用蒸馏水冲洗3次，每组处理重复3次。将冲洗后的种子均匀地铺在垫有2层滤纸的培养皿中，滤纸下方铺有吸水棉以保湿，于22～25 ℃恒温光照培养箱中进行种子发芽处理，光照1 200 lx。

1.2.2发芽指标测定

播种后每日09：00统计种子发芽数至发芽数不变，以胚根突破种皮作为发芽成功的标准。发芽结束后，各处理随机抽取5株幼苗，直尺测定其根长、芽长。各发芽相关指标计算公式如下：

种子发芽率(%)=(各处理种子发芽数/各处理种子总数)×100%；

相对发芽率(%)=(各处理种子发芽总数/对照组发芽总数)×100%；

相对致死率(%)=[(对照组发芽总数-各处理种子发芽总数)/对照组种子发芽总数]×100%。

1.2.3数据处理

采用Excel软件对原始数据进行记录，SPSS 19.0软件对不同浓度和时间处理种子的发芽率、相对发芽率、相对致死率等指标进行单因素方差分析及多重比较，采用Origin 2017软件制图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度EMS处理12 h对醉鱼草种子萌发的影响

由表1可知，种子浸泡处理12 h，不同浓度EMS诱变剂对种子的始发芽日、种子发芽率、相对发芽率、相对致死率均具有显著性影响，且呈现规律性变化。醉鱼草种子经EMS处理后于第3天开始发芽，当EMS溶液浓度达到1.2%时，种子的萌发时间明显延缓。与对照相比，除0.4%浓度外，醉鱼草种子的发芽率、相对发芽率均随EMS浓度的升高而降低，且浓度越高，发芽率下降速率越大。其浓度在2.0%～3.0%梯度下，相对发芽率下降6.0%，下降速率最快。当EMS浓度为0.8%～1.6%时，发芽率、相对发芽率与对照相比具有显著差异，当EMS浓度为2.0%和3.0%时，差异极显著。

2.2 不同浓度EMS处理24 h对醉鱼草种子萌发的影响

由表2可知，与12 h处理相同，高浓度EMS溶液对种子的发芽具有抑制作用，且随着EMS浓度的升高，种子的发芽率具有增加的趋势。当诱变剂浓度为0.4%、1.2%时，发芽率分别为73.33%和74.33%，均大于对照组。浓度在2.0%～3.0%范围内，发芽率、相对发芽率下降，相对致死率上升，与其他组相比均具有显著差异。其中浓度为3.0%时，发芽率最低，为53%，与对照相比下降了19%。0.4%～1.6%范围内，与对照组相比，发芽率、相对发芽率和相对致死率均不存在显著差异，不具统计学意义，其中浓度为3.0%时相对致死率最高，为26.62%，未达到LD50。

表1 不同浓度EMS溶液在12 h条件下醉鱼草种子的发芽情况

注：表中不同小写字母表示差异达显著水平。下同。

表2 EMS溶液在24 h条件下醉鱼草种子的发芽情况

2.3 不同浓度EMS处理48 h对醉鱼草种子萌发及幼苗生长的影响

由表3可知，48 h处理下，高浓度EMS抑制种子发芽，且随着浓度的不断升高，发芽率、相对发芽率逐渐下降，相对致死率逐渐上升。浓度为0.8%或更高时，种子的发芽率、相对发芽率及相对致死率与对照组相比均具有显著差异。当EMS浓度为3.0%时，种子的发芽率为30.33%，以半致死量为参照，该浓度为48 h处理下最佳诱变剂量。

2.4 不同浓度EMS和时间诱变处理对醉鱼草种子萌发的影响

由图1可见，在3个不同时间(12、24、48 h)及不同浓度的EMS处理下，醉鱼草种子的发芽率整体均呈下降趋势，且同一浓度下，处理48 h后的发芽率明显低于其他2个处理时间(12、24 h)。12 h和48 h处理下，发芽率变化趋势基本一致，而在24 h处理下，EMS浓度在0.8%～1.2%范围内时发芽率呈明显的增高趋势。浓度为2.0%～3.0%时，3个时间处理下发芽率均显著下降，其中48 h处理下种子的发芽率下降速度最快，对种子的毒害作用最大。24 h处理下，当EMS浓度为1.6%～2.0%时，发芽率的下降速率最快。12 h处理时，0.4%～0.8%浓度范围下，发芽率的下降速率最快。EMS浓度为1.2%和1.6%时，24 h处理条件下发芽率最高，为分别为74.33%和72%，显著高于24 h和12 h处理。3.0%EMS浓度下，各处理发芽率均取得了最低值，依次为27.36%、26.62%、49.90%。

表4 不同时间和浓度处理对醉鱼草种子发芽及幼苗生长的影响

表3 EMS溶液处理48 h条件下醉鱼草种子的发芽情况

图1 不同浓度EMS溶液对醉鱼草种子发芽率的影响

2.5 不同浓度EMS和时间诱变处理对醉鱼草幼苗生长的影响

从图2可见，随EMS浓度的升高，不同时间处理下，幼苗长度均呈不断下降的趋势。12 h处理下，2.0%和3.0%两浓度处理后幼苗长度与对照和0.4%浓度比较，存在显著差异，其中0.4%和0.8%处理下幼苗长度下降0.25 mm,下降幅度最大，且该浓度范围内种子的发芽率下降速率较其他组间也最快(见表1)。24 h处理下，各浓度间幼苗长度无显著变化，3.0%浓度下，幼苗长度最低，为0.97 mm,与对照组长度仅相差0.27 mm,差异不大。48 h处理下，3.0%浓度处理后幼苗长度与对照及其他浓度处理相比存在显著差异。同一浓度处理条件下，除0.4%浓度在12 h处理下幼苗长度高于其他2个处理时间，其他浓度处理下，幼苗的长度均表现为，24 h处理下幼苗长度最高，其次为12 h处理，最短为48 h处理。

图2 不同浓度EMS溶液对醉鱼草幼苗生长的影响

2.6 不同浓度EMS和时间诱变处理对醉鱼草种子萌发及幼苗生长的方差分析

从表4可知，不同时间对醉鱼草种子发芽率、幼苗长度影响极显著(p<0.01)，不同浓度处理对发芽率也存在极显著影响。浓度和时间相互作用时，发芽率呈现显著差异，对幼苗长度无显著影响。由此可见，时间、浓度以及时间和浓度的相互作用是影响醉鱼草种子发芽率的主体因素，浓度、时间是影响幼苗生长的主体因素。

3 讨 论

研究结果表明，不同浓度和时间对醉鱼草种子发芽时间、发芽率及幼苗生长均具有显著的影响，经EMS处理后，醉鱼草种子的发芽起始时间和进程延缓，且低浓度对种子发芽率有一定的促进作用，云娜等[26]对蒙红种子的研究中也得出了相同的结论，而随着浓度不断增高，种子的发芽普遍会受到抑制，发芽率会显著降低，这与杨楠等[27]对知母(Anemarrhenaasphodeloides)种子的研究、张玥等[28]对无芒雀麦(Bromusinermis)种子的研究结果一致。EMS是通过溶解产生有机酸从而对种子产生毒害作用，低浓度情况下则作用效果弱[29]。浓度和时间是决定诱变效果的关键因素，研究显示，不同物种对EMS的敏感度不同，这可能与种子的结构、种皮的透水性、种子的大小及种子内部的休眠机制有关。慎家辉等[30]用EMS对杜梨(Pyrusbetulifolia)种子进行处理，结果表明0.4%体积浓度处理诱变效果最好。臧辉等研究发现,1.5%浓度为EMS诱变羊草(Leymuschinensis)种子的优化体系[31]。本次试验结果表明，EMS浓度为3.0%，处理48 h,种子相对发芽率为50.10%，最接近半致死浓度，所以该组合为EMS诱变醉鱼草的半致死剂量。

研究发现，醉鱼草种子细小、种皮坚硬，外被细绒毛，能在土壤中建立种子库，这些特征都是自然演变下利于其种子自然生存繁衍的有利进化。由此说明，种子具有一定的抵抗外界侵害的能力。对诱变处理后的醉鱼草幼苗进行长度的测定，与其他两组处理时间比较，24 h处理下并未呈现出处理时间越长，幼苗长度越短的态势，且0.8%～3.0%范围内，24 h时间处理幼苗长度均高于12 h处理组，当浓度为1.2%和1.6%时，种子发芽率明显高于其他时间处理组，原因可能是该时间处理下，醉鱼草种子内的多种类黄酮物质[32-33]开始结合植物毒素、调控基因表达，保护植物器官，从而降低了EMS对幼苗生长的损害[34]。植物种子萌发受相关萌发基因控制，EMS可能激发抑制植物种子萌发的基因或改变植物种子萌发基因的表达[35]。不同植物基因的表达在不同的时期及组织具有非常复杂的调控模式，但其具体调控机制还有待进一步研究。

本试验通过对3个时间段下，不同浓度的EMS溶液对醉鱼草种子进行诱变处理，通过对各组发芽率、幼苗长等指标进行分析研究，最终得到了在EMS处理下醉鱼草种子各指标的变化规律，并确定了EMS诱变醉鱼草种子的半致死组合，结果可为醉鱼草的诱变体库建立及诱变育种提供参考。